Kunan†Kunan direccion: OX11 0DE, Reino Unido, Diamond Building, Harwell Ciencia y Innovación Park, Dietcote, Oxfordshire, Reino Unido, Diamond Light Source Co., Ltd., Centro de Imagen Biológica Electrónica.
Chay reacción centro k'anchay-cosechamiento complejo 1 (RC-LH1) nisqaqa morado fototróficos bacterias nisqap fotosintético nisqap ukhun kaq componentenmi. Iskay crio-electrónico microscopía estructuras nisqakunata riqsichirqayku chay complejo RC-LH1 nisqamanta Rhodopseudomonas palustris nisqamanta. Kay 2,65-Å resolución estructura kay RC-LH114-W complejo kaqmanta 14 subunidad LH1 bucles kaqmanta ruwasqa kachkan kay RC muyuriqpi, kaytaq kay proteína W kaqwan interrumpido kachkan, kay complejo mana proteína-W kaqwan kaqtaq tukuyninpi RC composición RC kaqwan muyurisqa kachkan. Wichqasqa 16 subunidad LH1 llalliq. Kay estructuras tupachiyqa qun qhawaykunata kay dinámica kaqmanta kay quinona kaqmanta kay complejo RC-LH1 kaqpi, kaypi ñawpaq mana determinasqa cambios conformacionales kaqmanta mayk’aqchus kay quinona kaqman hukllanakunku kay RC QB kaqpi, chanta kay maypi kachkanku kay sitios de unión quinona auxiliar kaqmanta, kaytaq yanapan kay RC kaqman pasayta. Kay sapalla estructura kay W proteína kaqmanta hark’an kay LH1 bucle wichq’akuyninta, chaywan huk canalta ruwan kay quinona/quinolona intercambio usqhaylla ruwanapaq.
Fotosíntesis nisqawan qusqa kallpaqa yaqa llapan kay pachapi kawsaqkunatam kawsachinman, intimanta biotecnología nisqapaqpas ancha atiyniyuqmi. Kay pachantinpi fotosíntesis nisqa kallpachaspapas, morado fototróficos nisqa bacterias nisqakunapas imaymana kallpa modokunatan rikuchinku, metabólico nisqa atiykunatapas. Paykunaqa fotosíntesis nisqamanta karunchakuyta atinku, tutayaqpi heterotróficas bacterias nisqa hina wiñayta atinku, nitrógeno nisqatapas dióxido de carbono nisqatapas allichayta atinku, hidrógeno nisqatapas paqarichiyta atinku, compuestos aromáticos nisqakunatapas pisiyachiyta atinku (1-3). Chay ruwaykunapaq kallpata qunapaqqa, achkiqa utqaylla, allintam qumiku kallpaman tikrana. Kay ruwayqa qallarikunmi chay complejo de antena k’anchay hap’iq k’anchayta ch’unqaspa chay hap’isqa kallpata centro de reacción (RC) nisqaman apachiqtin, chaywanmi carga t’aqanakuy qallarikun (4 – 7). Kay unidad básica fotosíntesis kaqmanta kay bacterias fototróficas morado kaqpi ruwasqa kachkan kay tipo 2 RC kaqmanta, muyurisqa kay complejo-cosecha de luz 1 (LH1) kaqwan, kay complejo núcleo RC-LH1 kaqmanta ruwaspa. LH1 nisqaqa huk matriz de heterodímeros curvados αβ nisqawanmi ruwasqa kachkan, sapakamam iskay clorofila bacteriana (BChl) a moléculas nisqakunata huk utaq iskay carotenoides nisqakunatapas hukllawakun (8-12). Aswan sasan LH1 antena 16 utaq 17 αβ heterodímeros RC (9-13) muyuriqpi huk wichqasqa buclepi, ichaqa huk núcleo complejos kaqpi, transmembrana péptidos interrumpinku kay muyuriq LH1 , Chaywan kallpachan kay quinol/quinona difusión kay RC chaymanta citocromo bc1 complejo (11, 13-15). Purpura fototrófico yura Rhodopseudomonas (Rps.) nisqaqa huk rikch'aq kawsaqmi , fotosíntesis nisqap yanapaqnin kallpata , iliktrunkunap apachiynintapas hamut'ayta atin. Ñawpaq kaq kristal estructura de Rps. Kay modelo kay complejo palustris RC-LH1 kaqmantaqa RC kaq, muyurisqa 15 heterodiméricos LH1 bucles kaqwan, kaytaq huk mana riqsisqa proteína kaqwan interrumpido kanku “Proteína W” (14). Kay proteína-W chaymanta riqsichikurqa kay RPA4402 hina, kaytaq huk mana caracterizasqa 10.5kDa proteína kimsa predicado transmembrana hélices (TMH) kaqwan ( 16 ). Proponeyku kay rpa4402 gen codificador proteína W kaqta pufW kaqman sutichayta, kay nomenclatura kaqwan tupaq kananpaq kay genes codificadores RC-L, M (pufL, pufM) chaymanta LH1α, β (pufA, pufB) subunidades kaqpaq. Musphaymi, proteína-Wqa yaqa 10% RC-LH1llapim kachkan, chaymi Rps. palustris iskay chikan RC-LH1 complejos nisqakunata ruwan. Kaypi, willayku hatun resolución crio-EM (cryo-EM) estructuras iskay complejos núcleos, huknin proteína W kaqwan chaymanta 14 αβ heterodímeros kaqwan, huknintaq mana proteína W kaqwan chaymanta huk wichqasqa 16 Heterodímero LH1 bucle kaqwan. Estructuraykuqa representan huk paso cambiota entiendeypi chay complejo RC-LH1 de Rps. palustris, imaraykuchus sapa variantemanta población homogénea nisqamanta t’aqwirqayku, chanta suficiente resolución nisqayuq kayku sapa péptido nisqamanta sut’ita asignanapaq chanta pigmentos ligados nisqamanta chanta lípidos chanta quinonas relacionados nisqamanta ima. Kay estructuras tupachiyqa rikuchin kay kimsa TMH proteínas-W mana tarisqa mayqin wak complejo RC-LH1 kaqpi kunankama huk canal de quinona kaqta paqarichimunku kay intercambio quinona/quinolona usqhayllata ruwanankupaq. Huk yupay waqaychasqa lipídico chaymanta quinona hukllanakuy sitiokuna riqsichisqa kanku, chaymanta huk musuq conformacional tikrayta riqsichirqayku quinonawan RCwan kuskanchasqa kaptin, chaymi allin kanman fotosistema II (PSII) RC kaqpaq organismos fototróficos oxigenados kaqpaq. Kay tarisqaykuqa musuq hamut’aykunata qun kay cinética kaqmanta kay quinona/quinolona hukllanakuymanta chanta kay intercambio kaqmanta kay RC-LH1 complejo núcleo kaqpi kay bacterias fototróficas morado kaqmanta.
Chaynapim Rps. palustris, sapa RC-LH1 nisqatam sapaqchanchik métodos bioquímicos nisqawan. Kay complejo proteico W-deficiente (kaymanta ΔpufW sutichasqa) chuyanchasqa karqa kay cepa mana pufW gen kaqwan ( 16 ), chaymanta huk complejo RC-LH1 kaqlla ruwayta atikun. Chay proteína W nisqayuq complejo nisqaqa huk cepa nisqawanmi rurasqa. Kay cepamanta proteína W kaqqa huk 10x His etiquetawan C-terminalninpi tikrasqa kachkan, chayrayku kay complejo proteína W kaqwan allinta hukllawakunman aswan pisi proteína W kaqwan metalta mana kuyuchispa. Chay complejoqa allintam rakisqa kachkan (16) Cromatografía de Afinidad (IMAC).
Imaynan rikukun 1 yupaypi hina, iskaynin complejos nisqakunan kanku kinsa subunidad RC (RC-L, RC-M y RC-H) muyurisqa huk antena LH1 nisqawan. Kay 2.80-A estructura kay complejo mana proteína-W kaqwan rikuchin 16 αβ heterodímeros kaqta, huk wichqasqa LH1 bucleta ruwaspa tukuyninpi RC muyuriqpi, kaymanta sutichasqa kay complejo RC-LH116 kaqwan. Kay 2,65Å estructura kay proteína-W-conteniendo complejo kaqmanta huk 14-heterodímero LH1 interrumpido kay proteína-W kaqwan, kaymanta RC-LH114-W sutichasqa.
(A y B) Compuesto nisqapa hawanpi rikuchiy. (C y D) Pigmentos ligados expresados ​​en varias. . esferoides nisqa complejo (13)]. LH1-αpaqqa, subunidad proteica nisqap llimp'inqa q'illu; LH1-β kaqpaqqa, subunidad proteica nisqap llimp'inqa azulmi; proteína-W nisqapaqqa, proteína nisqa puka; RC-Hpaqqa, cianmi; RC-L nisqapaqqa Naranja nisqa; RC-M nisqapaq, magenta nisqa. Cofactores nisqakunaqa varillas nisqawanmi rikuchikun, verde nisqataq BChl nisqawan BPh a nisqawan, morado nisqawantaq carotenoides nisqawan, q’illutaq UQ10 nisqawan. (G y H) Hatunchasqa qawariy chay brecha proteica-W nisqamanta chay región equivalente nisqapi complejo RC-LH114-W (G) nisqapi chaymanta complejo RC-LH116 (H) nisqapi. Cofactores nisqakunam qawachikun espacio huntachiy hina, quinona quelada nisqa azulwan qawachikun. Chay proteína-W nisqa ch’usaqmi (G) nisqapi azul ch’iku chiruwan resaltasqa, chaymantataqmi huch’uy t’oqokunaq maypichus quinona/quinolol difusa chay anillo LH116 nisqapi resaltasqa kashan (H) nisqapi yana chiruwan.
Figura 1 (A y B) nisqapim qawarikun RC muyurisqa kichasqa utaq wichqasqa matrizes de heterodímeros LH1αβ nisqawan, sapakamam iskay BChl nisqawan huk carotenoide nisqawan hukllawakunku (Figura 1, C y D). Ñawpaq yachaykunaqa rikuchirqanku kay Rps kay complejo LH1 kaqta. Kay biosintética ñanpi kay espirulina xantina kaqmanta, kay especies kaqkunapiqa kanku poblaciones mixtas de carotenoides (17). Ichaqa, espiropirroxantina nisqa carotenoide dominante nisqa, densidad nisqataqmi kusichiq. Chayrayku, akllarqayku espiroxantinata tukuy LH1 hukllanakuy sitiokunapi modelo ruwayta. Kay alfa chanta beta polipéptidos kaqkunaqa sapalla TMHs kanku kay pisi membrana hawa regionesniyuq ( Figura 1, A, B, E, F ima). Manaña C-terminalpi 17 residuokuna densidadnin qawarisqachu kaptinpas, polipéptido alfaqa Met1manta Ala46kamam iskaynin complejokunapi rakisqa karqa. β polipéptido nisqa pisiyachisqa karqan Gly4manta Tyr52man RC-LH116 nisqapi, hinallataq Ser5manta Tyr52 nisqaman RC-LH114-W nisqapi. Mana densidad 3 utaq 4 N-terminal utaq 13 C-terminal residuokuna rikukurqachu (S1 siqi). Análisis de espectrometría de masas nisqa chay complejo RC-LH1 mixto nisqamanta, chay cepa de tipo sallqamanta wakichisqamanta, rikuchirqa chay faltasqa suyuqa chay péptidos nisqamanta heteróloga escisión nisqamanta ruwasqa kasqanmanta (S1 y S2 siqi). Chaynallataqmi qawarikurqa α-Met1pa formulación N-terminal nisqapas (f). Kay anlisis rikuchirqa kay α-péptido kaqqa kay residuos fMet1 kaqmanta kay Asp42/Ala46/Ala47/Ala50 kaqkama, chanta kay β-péptido kaqqa kay residuos Ser2 kaqmanta kay Ala53 kaqkama, kaytaq allin acuerdopi kachkan kay mapa de densidad EM pisi temperatura kaqwan.
Coordinación kay α-His29 kaqmanta chanta kay β-His36 kaqmanta ruwan BChls uyapura; sapa αβ heterodímero vecinonkunawan huñunakunku huk kichasqa llimp’i (RC-LH114-W) utaq huk wichq’asqa llimp’i (RC-LH116) RC muyuriqninpi The exciton acoplado pigmento matriz (1, C y D siqi). RC-LH114-Wpa 877 nm bandawan tupachisqaqa, RC-LH116pa 880 nm absorción puka desplazamientonmi 3 nm (2A siqi). Ichaqa, espectro de dicroismo circular nisqa yaqa kaqllam (2B siqi), chaymi qawarichin kichasqawan wichqasqa llallinakuypi sutilla chikan kaptinpas, BChls nisqapa local pachamamanqa ancha rikchakuqmi. Chay absorción puka desplazamientoqa kanmanmi pisiyachisqa movimiento térmico nisqamanta hinallataq yapasqa estabilidad nisqamanta chay wichqasqa lazopi (18, 19), chay cambio de acoplamiento de pigmento nisqamanta, chaymi kanman chay acoplamiento de pigmento nisqapi, chaymi kanman chay wisq’asqa lazo nisqapi (20, 21), utaq huk combinación nisqa kay iskay efectos nisqamanta (11).
(A) Espectro de absorción ultravioleta/visible/cerca-infrarrojo, chaypa picosninqa marcasqa kanku pigmentos correspondientes nisqawan chaymanta normalizasqa kanku pico BPh nisqaman 775 nm nisqapi. (B) Espectro dicroismo circular normalizado BChl absorbanciaman 805 nm nisqapi. (C y D) Akllasqa ΔA espectros nisqamanta chay pacha-resolvido absorción espectros nisqamanta RC-LH114-W complejo (C) chaymanta RC-LH116 complejo (D) nisqamanta. Aswan allin tupachiypaqmi llapa espectrokuna normalizasqa kanku ∆A de −A nisqaman 0,2 ps nisqapi. (E) Chay tasa de oxidación de citocromo c2 irradiación nisqamanta qhipaman imaymana concentraciones de UQ2 kaptin (qhaway Figura S8 nisqapi crudo nisqamanta). (F) Pisi, chawpi utaq hatun kallpayuq k’anchaypi wiñasqa células nisqapi (10, 30 utaq 300μMm-2 s-1, chaymanhina), chay proteína W chaymanta RC-L subunidades nisqakuna chay complejo purificado nisqapi chaymanta chay t’aqasqa membrana nisqa ratio nisqapi. Kay nivel proteico kaqta kay electroforesis de gel SDS-poliacrilamida kaqwan chanta kay inmunoensayo kaqwan ima (qhaway kay S9 siq’ita kay crudo willaykunapaq). Chay chuyanchasqa RC-LH114-W complejo nisqawan tupachisqa ratio nisqa tariy. Chay RC-Lpa proteína-W nisqawan chay complejo nisqapa ratio estequiométrico nisqa 1:1 nisqa.
Chay BChls 1 kaq posiciónpi RC-LH114-Wpa deformado αβ14 bucle nisqapi (1, A, C, E siqi) aswan hichpallapim kachkanku RC primario donante (P) nisqaman 6,8Å nisqapi, RC-LH116 nisqapi kaqlla BChls nisqamantaqa (1, B, D, F, hinaspa S3 siqi); ichaqa, chay iskay complejos nisqapa cinética de absorción transitoria nisqa qawarichinmi RC-LH114-W y RC-LH116 nisqapahqa, LH1manta RCkama excitación energía transferencia tiempo constantes nisqa 40 ±4 y 44±3 ps kasqankuta (2 yupay). , C y D, Siqi S4 y Cuadro S2). Hinallatahmi mana ima hatun chikanchakuypas kanchu RC ukupi transferencia electrónica nisqapi (S5 siqiwan chaywan tupaq texto suplementariowan). Sospechayku chay LH1wan RC-Pwan pacha transferencia energética nisqapa estrecha correspondencia nisqa, chay iskay LH1 bucles nisqapi aswan achka BChl nisqapa chayna karu kaynin, ángulo nisqapa chaymanta energía potencial nisqa kasqanrayku. Yaqachus hina chay LH1 nisqapa kallpanpa ruwayninta maskayqa chay aswan pisi karuman chayanapaqqa manam aswan utqayllachu chay subóptimo nisqa sitiokunamanta RC nisqaman chiqap kallpapa apachiymantaqa. Chay kichasqa-bucle LH1 bucle RC-LH114-W kaqpipas mana ancha chaniyuq kuyuy térmico nisqatam pasanman pisi temperatura nisqapi análisis estructural nisqapaq, chaymantam kan aswan unay αβ14 anillo conformación nisqa temperatura ambiente nisqapi βBChls nisqapa pigmentación karunmanta RC 1 nisqapa posiciónninpi.
Chay complejo RC-LH116 nisqapiqa 32 BChls nisqa 16 carotenoides nisqakunam kachkan, chaymantam tukuyninpi churakuyninqa kikinmi chay Thermochromatium (Tch.) pidpidum [Protein Data Bank (PDB) ID 5Y5S] (9), Thiorhodovibrio (Trv.) 970 cepa ( PDB ID 7C9R) (12) hinaspa verde nisqamanta hurqusqawan algas (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10) nisqamanta. Alineación ruwasqamantaqa, uchuy desviacionesllam qawarikurqa αβ heterodímeros nisqapa posiciónninpi, aswantaqa 1-5, 15, 16 nisqapi (S6 siqi). Kay proteína-W kaqpa kayninqa huk hatun impactoyuq kay LH1 kaqpa estructuranpi. Kimsa TMHsninqa pisi bucles nisqawanmi tinkisqa kachkanku, N-terminal nisqataq complejo nisqapa lumen ladonpi, C-terminal nisqataq citoplasmático nisqapi (1A y 3 siqikuna, Amanta Dkama). Proteína-W aswanta hidrofóbico (3B siqi), TMH2wan TMH3wantaq LH1αβ-14wan tinkinku, transmembrana hawata ruwanankupaq (3, B, Emanta Gkama). Chay interfazqa aswantaqa Phe, Leu hinaspa Val residuokunamantam ruwasqa kachkan chay transmembrana suyupi. Kay puchukunaqa aminoácidos hidrofóbicos nisqawan, αβ-14 pigmentos nisqawan ima pilasqa kachkan. Wakin residuos polares nisqapas yanapakunkum chay interacción nisqapi, chaymantam W-Thr68wan β-Trp42wan hidrógeno nisqapa watakuyninpas chay compleja cavidadpa hawanpi (3, F hinaspa G siqi). Citoplasma nisqap hawanpiqa Gln34 nisqaqa αβ-14 carotenoides nisqap ceto nisqa huñunwan kuskam kachkan. Chaymantapas, n-dodecil β-d-maltósido (β-DDM) molécula nisqa allichasqa karqa, chaymanta hidrofóbico chupan mastarikurqa interfaz nisqaman proteína-Wwan αβ-14wan, chaymanta lipídico chupanpas cuerpopi tarikunman. Hinallataqmi repararqayku chay regiones de resolución C-terminal nisqa proteína W nisqamanta, RCH nisqamantawan ancha qayllallapi kasqankuta, ichaqa manan chay alcance ukhupichu kanku interacciones específicas nisqakuna ruwanankupaq (Figura 1, A y E). Ichaqa, kay iskay proteínas kaqpa mana allichasqa C-terminal aminoácidos nisqapiqa kanmanmi interacciones nisqakuna, chaymi huk mecanismota qunman kay proteína-W reclutamiento nisqapaq kay complejo RC-LH114-W nisqa huñunakuypi.
. (B) Proteína-W hidrofóbico llimp’iyuq hawawan rikuchisqa. Polar nisqapas, cargada nisqapas cian nisqawanmi qawarichikun, hidrofóbico nisqapahmi yuraqwan, sinchi hidrofóbico nisqapas naranja nisqawanmi qawarichikun. (C y D) Proteína-W dibujo animado nisqapi rikuchisqa, orientacionninqa (A) (C) nisqapi hina kaqlla, hinaspa 180° (D) nisqawan muyurisqa. Secuenciapi posición nisqaman hinaqa, chay residuos distinguibles nisqakunam arco iris color esquema nisqatam adoptanku, chaypim N-terminal nisqa azul, C-terminal nisqataq puka. (E) Proteína-W kaqlla qawariypi (A) nisqapi hina, chaynallataqmi residuos nisqakuna proteína-W:LH1 nisqapa interfazninpiqa, k’askasqa marcayuq varillakunawanmi qawachikun. (F) Proteína-W 90° muyuchisqa kachkan (E) nisqawan LH1αβ14 nisqawan tupachisqa dibujo animado nisqapi, chaynallataqmi residuos de interfaz nisqawan tupachisqa barrapa rikuchiyninpi. Chay beta polipéptido nisqamanta hawa warkusqa puchukunaqa etiquetasqam kachkan. Chay cofactorqa 1 yupaypa llimpinwan tupaq barra hinam qawarichikun, ismusqa β-DDM nisqataqmi griswan qawarichikun, oxígeno nisqañataqmi pukawan. (G) (F) nisqapi qawariyqa 180° muyuchisqam, chaypim riqsisqa residuos nisqakuna etiquetado alfa polipéptido nisqamanta.
Proteína-W nisqaqa huk αβ heterodímero nisqatam tikran (15 kaq siqipim 1F nisqapi), chaywanmi harkan bucle wichqakuyninta hinaspam ñawpaq kimsa αβ heterodímeros nisqakunata k'umuykachin. Chaytahmi qawarikurqa chay ángulo máximo de inclinación nisqa punta kaq heterodímero αβ-1 nisqamanta chay normal de película nisqawan tupachisqaqa 25°manta 29°kama (Figura 1, A y E), chaymi formasqa karqa 2°manta 8°kama inclinacionninwan αβ-1 RC A sinchi contraste-LH116 nisqapi (Figura 1, B y F). Iskay kaq, kimsa kaq heterodímeros nisqakunaqa 12°manta 22°kama, 5°manta 10°kamam inclinasqa kachkanku. RCpa harkakuynin estérico kasqanraykum, αβ-1pa inclinacionninqa mana iskay kaq paris αβ nisqawanchu (chayqa tupanmi 16 kaq αβ nisqawan 1F siqipi), chaymi LH1 anillopi chuya ch’usaqta ruwan (1, A hinaspa E siqi) . Iskay αβ heterodímeros mana kasqanrayku, tawa BChl iskay carotenoides chinkachiywan kuska, mana mayqin carotenoidespas αβ-1 subunidad torcido nisqaman hukllawakunchu, chaymi huk anillo LH114-W nisqapi 13 carotenoides Vegetarianos nisqawan 28 BChls nisqawan ima. Chay iskay complejos nisqapa estimaciones de resolución local nisqa αβ1manta 7kama regionkunapiqa aswan pisillam kanku wakin LH1 bucle nisqamanta, chaymi qawarichinman plasticidad inherente nisqa subunidad LH1 nisqapa RC QB sitiowan kuska kaqta (4 kaq siqi) .
Chay siq’ikunaqa RC-LH114-W (A y B) hinallataq RC-LH116 (C y D) nisqakunan rikuchikun kikin patamanta/lado qhawariymanta (A y B) (A y C) hinallataq cavidad hawanmanta Fig. 1. (B y D). Paña ladopin rikukun colorniyoq llavekuna.
Chay sapallan huk complejo núcleo característica nisqa 1:14 ratio estequiométrico nisqawanmi Rhodococcus sphaeroides (Rba.) RC-LH1-PufX dímero (13). Ichaqa, proteína W chanta PufX mana sut’i homologíayuqchu kanku, chanta huk hatun impactoyuq kanku sapan LH1 estructurasninkupi. PufX huk sapalla TMH huk dominio citoplasmático N-terminal kaqwan mayqinchus kay lado citoplasmático kaqwan kay subunidad RC-H kaqwan (13) huk posición kaqpi Rps kaqwan tupaqpi interactúan. palustris LH116αβ-16 nisqa. PufX huk canalta ruwan kay intercambio quinona/quinolona kaqpaq kay RC-LH1 kaqwan kay complejo citocromo bcl kaqwan chanta tukuy Rba kaqpi kachkan. esfaeroides núcleo complejo (13). Monómero-monómero nisqa interfaz Rba nisqapi kaptinpas. Chay esferoides RC-LH1-PufX dímero nisqa tarikunmi RC-LH114-W nisqapi proteína W nisqapa hukllanakuyninpi, chaymantam PufX nisqawan proteína-W nisqawan inducisqa brecha nisqapas huk equivalente posición nisqapi kachkan (S7A siqi). Chay brecha RC-LH114-W nisqapiqa alineakuntaqmi hipotético canal de quinona (8) nisqawan Pseudomonas rosea LH1 nisqamanta, chaymi formasqa péptidos nisqawan mana proteína W nisqawan utaq PufX nisqawan tupaqkunawan (S7B siqi). Hinaspapas, chay canal de quinona nisqa Blc. Chay esmeralda verde LH1 ruwasqa huk subunidad γ (7) mana yupaspa, chayman rikchakuq posiciónpi tarikun (S7C siqi). Hukhina proteínas kaqwan mediasqa kaptinpas, kay canales de quinona/quinolol kaqpa rikhuriyninqa huk posición común kaqpi kay complejo RC-LH1 kaqpi huk ejemplo hina kanman kay evolución convergente kaqmanta, kaytaq rikuchin kay brecha ruwasqa kay proteína W kaqwan huk canal de quinona hina ruwayta atinman.
Kay brecha kay LH114-W bucle kaqpi permite formación huk región membrana continua kaqta kay espacio interno kay complejo RC-LH114-W kaqwan kay membrana bulto kaqwan ( Figura 1G ), aswanta kay iskay dominios kaqta huk poro proteico kaqninta tinkiyta kay proteínas kaqpi hina. Chay RC-LH116 complejo nisqa huk wichqasqa Tch nisqaman rikchakun. Agujaman rikchakuq complejo (22) (1H siqi). Imaraykuchus kay quinona difusión kay membrana kaqninta aswan usqhayta kay difusión kay estrecho canal proteico kaqninta, kay kichasqa LH114-W lazoqa aswan usqhayta RC tikrayta saqinman kay wisq’asqa LH116 bucle kaqmanta, chanta kay quinona difusión kay RC kaqman aswan hark’asqa kanman. Kay pruebapaq sichus proteína W afectan kay quinonas tikrayta RC kaqnintakama, ruwarqayku huk ensayo de oxidación citocromo huk cierta concentración ubiquinona 2 (UQ2) (huk análogo natural UQ10 aswan pisi isopreno chupayuq) (Figura 2E). Aunque kay quinona quelado kaqpa kayninqa hark’an kay chiqan determinación kay constante Michaelis aparente kaqmanta (RC-LH114-W chanta RC-LH116 allin kanku kay 0,2±0.1μM chanta 0,5±0.2μM, respetuosamente), kay tasa máxima kay RC-LH114-W kaqmanta ( 4.6±0.2 e-RC-1 s-1) kachkan 28±5% aswan hatun RC-LH116 kaqmanta (3,6±0,1 e-RC-1 s-1).
Qallariypiqa yuparqayku kay proteína-W kaqta yaqa 10% kaqpi kay complejo núcleo kaqpi ( 16 ); kaypiqa, chay tasas de ocupación nisqa pisi k’anchayniyuq, chawpi k’anchayniyuq, hatun k’anchayniyuq wiñaynin células nisqapiqa 15±0,6%, 11±1%, 0,9±0,5 ima, chaymanjina % (Siqi 2F). Comparación cuantitativa de espectrometría de masas nisqa qawarichirqa chay etiqueta histidina nisqa yapayqa mana pisiyachirqachu chay relativa abundancia de proteína-W nisqa sallqa cepas nisqawan tupachisqaqa (P = 0,59), chaymi kay niveles nisqakunaqa mana artefactochu kanku proteína-W modificada nisqamanta (S10 siqi). Ichaqa kay pisi ocupación kay proteína-W kaqmanta kay complejo RC-LH1 kaqpi wakin RCs kaqkunaman huk ritmo usqhayta t’ikrayta atinman, chaywantaq kay aswan pisi intercambio quinona/quinolona kaqmanta kay complejo RC-LH116 kaqpi pisiyachinman. Repararqayku kay hatun k’anchay ocupación tasa mana tupaq kaqta kay qhipa transcriptómica willaykunawan, kaytaq rikuchin kay pufW gen expresión yapakusqanmanta sinchi k’anchaypi ( Figura S11 ) (23). Kay diferencia kay pufW transcripción kaqwan kay proteína-W incorporación kaqwan kay RC-LH1 complejo kaqman pantachiq chanta kay compleja regulación kay proteína kaqmanta rikuchinman.
RC-LH114-W nisqapiqa 6 cardiolipina (CDL), 7 fosfatidilcolina (POPC), 1 fosfatidilglicerol (POPG) hinaspa 29 β-DDM moléculas nisqakunam asignasqa hinaspa modelasqa kachkanku chaypi 6 CDLs, 24 POPCs, 2 POPGs hinaspa 12 βDDMs. RC-LH116 (5, A y B siqi). Kay iskay estructuras nisqapiqa, CDL nisqa yaqa citoplasmático lado complejo nisqapi tarikun, POPC, POPG, β-DDM nisqataq aswantaqa luminal lado nisqapi tarikun. Iskay moléculas lípidas y detergentes nisqakunam sapaqchasqa karqa αβ-1manta αβ-6kama región nisqapi RC-LH114-W complejo nisqapi (5A siqi), pichqañataqmi RC-LH116 nisqapa equivalente región nisqapi (5B siqi). Aswan lípidos tarikurqa huk lado complejo kaqpi, aswantaqa CDL, huñusqa RCwan αβ-7wan αβ-13kama ( Figura 5, A y B). Huk lípidos estructuralmente resolvidos chaymanta detergentes kaqkunaqa LH1 anillo hawapi tarikunku, chaymanta allin allichasqa cadenas acilkuna LH1 subunidades chawpipi mastarikunku, tentativamente β-DDM hina RC-LH114-W kaqpi sutichasqa, chaymanta β-DDM hina definisqa RC kaqpi Huk chaqrusqa β-DDM chaymanta POPC-LH116 kaqpi. Chay rikch’aq posiciónkuna lípidos quelantes nisqamanta hinallataq detergentes nisqamanta estructuranchispi rikuchinku fisiológicamente relevantes sitios de unión kasqankuta ( Figura S12A ). Tch nisqapi kaqlla moléculakunap posiciónninkunapas allin consistenciayuqmi. Suave y Trv. Cepa 970 RC-LH1s (S12, Bmanta E siqi) (9, 12) chaymanta hidrógeno-unión residuokuna lipídico uma qutumanta allin allin waqaychasqa kayninta rikuchirqanku secuencia alineación nisqapi (S13 siqi), chaymi qawarichin Conservado CDL RC nisqaman hukllawakusqanmanta (24), kay sitiokunaqa RC-LH1 complejo nisqapi waqaychasqa kankuman.
. UQ RC QA y QB sitiokunaman watasqa q’illu, aislado UQtaq azul. (C y D) Kikin qhawariykuna (A) hinallataq (B), lipídicos nisqakuna mana churasqa. (Emanta Gkama) Hatunchasqa qawariy Q1(E), Q2(F) hinaspa Q3(G) nisqamanta RC-LH116manta, cadenas laterales nisqawan, chaymi huknin hukninwan influyen. Hidrógeno wat'akunaqa yana ch'iku chirukuna hinam rikuchikun.
RC-LH116 nisqapiqa, iskaynin RC QA nisqapas QB UQ nisqapas, carga rakiy ruwaypi electronkuna apachiypi yanapakuqmi, hukllanakusqanku sitiokunapi ismusqa kanku. Ichaqa RC-LH114-W nisqapiqa QB quinona nisqa mana allichasqachu, chaymi uraypi sut’ita rimasun. QA y QB quinonas nisqamanta aswantaqa, iskay moléculas UQ queladas (RC-LH1 anillokuna chawpipi tarikuq) RC-LH114-W estructurapi churasqa kanku allin allichasqa uma huñunkuman hina (Q1 hinaspa Q2 nisqapi tarikuq, chayman hina). kiti). Siqi 5C). Iskay unidad isopreno nisqakunam Q1 nisqaman churasqa kachkan, chaymantam mapa de densidad nisqa Q2pa 10 isopreno chupa huntasqakunata allichan. RC-LH116pa estructuranpim kimsa UQ10 queladas moléculas (Q1manta Q3kama, Figura 5D) allichasqa karqaku, llapan moléculakunam chupa densidadniyuq kanku tukuy chupapi (5 siqi, Dmanta Gkama). Chay iskay estructurakunapiqa, Q1pa, Q2pa quinona uma huñukunapa posiciónninqa allin consistenciayuqmi (S12F siqi), chaymi RCwanlla interactunku. Q1qa tarikunmi RC-LH114-Wpa W gap nisqapa yaykuyninpi (1G hinaspa 5 siqi, C, D hinaspa E), Q2ñataqmi tarikun QBpa hukllanakuyninpa hichpanpi (5, C, D siqi) hinaspa F). Chay waqaychasqa L-Trp143 y L-Trp269 residuos nisqakunaqa ancha hichpallapim kachkanku Q1wan Q2wan chaymi qunku potenciales interacciones π-apilamiento nisqakunata (Figura 5, E y F, y Figura S12). L-Gln88, 3,0 Å Q1pa distal oxígeno nisqamanta, sinchi hidrógeno nisqa watasqatam qun (5E siqi); kay residuoqa llapa RCkunapim waqaychasqa kachkan mana aswan karu relación nisqapichu (S13 siqi). L-Ser91qa conservadormi sustituido Thr nisqawan aswan achka huk RCkunapi (S13 siqi), 3,8 Angstrom nisqa Q1pa oxígeno metilo nisqamanta, chaymi pisi kallpayuq hidrógeno nisqa watasqakunata qunman (5E siqi). Q3 mana rikukunchu huk interacción específica nisqayuq, ichaqa tarikunmi región hidrofóbica nisqapi subunidad RC-M nisqawan subunidad LH1-α nisqawan 5manta 6kama (Figura 5, D y G). Q1, Q2 y Q3 utaq qaylla quinonas queladas nisqapas Tch. Llampu, Trv. Cepa 970 y Blc. Kay iris estructura (9, 10, 12) huk conservado auxiliar quinona hukllanakuy sitioman rikuchin kay complejo RC-LH1 kaqpi (S12G siqi). Chay pichqa ismusqa UQs RC-LH116 nisqapiqa allin acuerdopim kachkanku 5,8±0,7 sapa complejo nisqamanta cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) nisqawan determinasqawan, chaymantam kimsa ismusqa UQs RC-LH114-W nisqapiqa aswan pisilla kanku Chay tupusqa valor 6,2±0,3 (Fig. S14) nisqahmi qawarichin mana allichasqa UQ moléculas nisqakuna kasqanmanta.
Kay pseudo-simétrico L y M polipéptidos sapankanku pichqa TMHs nisqayuq kanku chaymanta huk heterodímero nisqatam ruwanku, chaymi hukllawakun huk BChl dímero, iskay BChl monómeros, iskay bacteriófago (BPh) monómeros, huk mana Heme hierro hinaspa huk utaq iskay UQ10 moléculas nisqakunata. Chay terminal cetona nisqa huñupi hidrógeno nisqa wat'akuna kasqanraykum, Rps nisqapi riqsisqa huñukuyninwanpas, carotenoides nisqakunam M-subunidad nisqapi churasqa, chaymi cis-3,4-dehidroorhodopina sutiyuq. Especies (25) nisqa. RC-Hpa hawa membrana dominionqa huklla TMHwanmi membranaman anclasqa kachkan. Tukuy RC nisqapa ruwayninqa rikchakunmi kimsa subunidad RC nisqaman rikchakuq especies relacionadas nisqaman (Rba nisqa hina). esferoides (ID PDB: 3I4D) nisqa. Chay macrociclos de BChl y BPh, chay columna vertebral carotenoides chaymanta hierro mana heme nisqa ima, chay estructuras nisqapa resolución nisqa ukunpim tupan, chaynallataqmi UQ10 uma huñupas QA sitiopi chaynallataq QB quinona nisqapas RC-LH116 nisqapi (S15 siqi).
Kay iskay RC estructurakuna hukniray QB sitio ocupación tasas kaqwan kayninqa huk musuq oportunidadta qun kay constante cambios conformacionales kaqta qhawanapaq kay QB quinona watakuywan kuska kaqta. Kay complejo RC-LH116 kaqpi, QB quinona tarikun kay hunt’asqa watasqa “proximal” posición kaqpi (26), ichaqa kay t’aqakuy kay RC-LH114-W kaqmanta mana QB quinonayuqchu. RC-LH114-W kaqpiqa mana QB quinona kanchu, kayqa musphaymi imaraykuchus kay complejo activo kasqanrayku, aswanta kay complejo RC-LH116 kaqmanta kay estructuralmente resolvida QB quinona kaqwan. Iskay LH1 anillokuna yaqa suqta quinonakunata quelaptinkupas, pichqaqa estructuralmentem allichasqa kachkan wichqasqa RC-LH116 anillopi, kimsallataqmi estructuralmente limitasqa kachkan kichasqa RC-LH114-W anillopi . Kay yapasqa trastorno estructural kaqqa rikuchinman aswan usqhayta sustitución kaqta kay RC-LH114-W QB sitios kaqmanta, aswan usqhayta cinética quinona kaqmanta kay complejo kaqpi, chanta aswan probabilidad kaqta kay LH1 bucle chimpaymanta. Sugeriyku kay mana UQ kay RC QB sitio kaqpi kay RC-LH114-W kaqpi kanman huk aswan complejo chaymanta aswan activo complejo kaqpa rurun, chaymanta kay QB sitio kay RC-LH114-W kaqpi chaylla congelasqa kachkan kay UQ tikraypi Kay etapa específica (kay sitioman yaykuy kay QB kaqman wichqasqa kachkan) rikuchin kay ruwaypa conformación kaqninta.
Mana QB kaptinqa, L-Phe217pa kuska muyuyninmi huk posiciónman, chaymi mana tupanchu UQ10pa watakuyninwan, chaymi huk colisión espacialta ruwanqa chupapa punta kaq unidad isopreno nisqawan (6A siqi). Hinallataqmi, chay sutilla hatun cambios conformacionales nisqakunaqa sutillam kachkan, aswantaqa hélice de (hélice corto nisqa TMH Dwan Ewan chawpipi bucle nisqapi) maypichus L-Phe217qa QBpa bolsillo de unión nisqamanmi tikrakun chaynallataq L-Tyr223 nisqapa muyuyninmanpas (6A siqi ) M-Asp45 marcowan hidrógeno nisqapa hukllawakuyninta pakinapaq hinaspa QBpa hukllanakuyninpa haykuyninta wichqanapaq (6B siqi). Hélice de pivot nisqa basenpi, L-Ser209pa Cα nisqa 0,33Å nisqawanmi tikrakun, L-Val221Cα nisqataq 3,52Å nisqawanmi tikrakun. TMH D y E nisqapiqa manam qawarinapaq hinachu tikrakuykuna kan, chaykunaqa iskaynin estructurakunapim superponible kanku (6A siqi). Yachasqanchikman hinaqa, kaymi punta kaq estructura RC naturalpi, chaymi wichqan QB sitiota. Huk tupachiy hunt’asqa (QB-unido) estructurawan rikuchin manaraq quinona pisiyachisqa kachkaptin, huk cambio conformacional necesitakun quinonaman yaykunanpaq. L-Phe217 muyurin π-apilamiento interacción ruwananpaq quinona uma qutuwan, chaymanta hélice hawaman tikrakun, chaywantaq L-Gly222pa esqueletonwan L-Tyr223 lado cadenawan hidrógeno watasqa llika ruwayta atinku huk takyasqa hidrógeno watasqa estructurayuq (6, A, C siqi).
(A) Holograma (Lcadena, naranja/M cadena, magenta) hinaspa apo (gris) estructurapa dibujo animado superpuesto, chaypim residuos clave nisqakuna qawachikun varilla hina representación nisqapi. UQ10 nisqaqa q’illu barrawanmi rikuchikun. Ch'iku chiruqa lliw rurasqapi hidrógeno wat'akuna kamasqakunatam rikuchin. (B y C) Kay representación superficial kay apolipoproteína kaqmanta chanta kay estructura anillo tukuymanta, kay oxígeno cadena lateral kaqmanta kay L-Phe217 kaqmanta azul kaqpi chanta kay L-Tyr223 kaqmanta kay puka kaqpi, chaymanta. L subunidad nisqa naranja; chay M y H subunidades nisqakunaqa manam llimpiyuqchu. (D y E) Apolipoproteína (D) hinallataq tukuy (E) RC QB sitiokuna [color por (A) respetuosamente] hinallataq Thermophilus thermophilus PSII (verde, azul quinona plásticawan; PDB ID: 3WU2) Alinea (58).
Mana suyasqa hina, aunque achka estructuras de RCs QB-deficientes mana LH1 kaqwan kanku chaypas, kay cambios conformacionales rikusqa kay estudiopi mana ñawpaqta willasqachu kanku. Kaykunaqa kanku QB pisiyachiy estructura Blc. viridis (ID PDB: 3PRC) (27), Tch. tepidum (ID PDB: 1EYS) (28) y Rba. esferoides (PDB ID: 1OGV) (29), llapanku yaqa kaqlla kanku tukuyninpi QB estructurankuwan. 3PRC nisqamanta allinta qawarispaqa qawarikurqam LDAO (Óxido de Lauryl Dimetil Amina) nisqa detergente nisqapa moléculas nisqakuna QB posición nisqaman yaykuypi hukllawakusqankuta, chaymi harkanman huk wichqasqa conformación nisqaman musuqmanta churayta. LDAO mana kikin posiciónpichu ismuptinpas 1EYS utaq 1OGV nisqapipas, kay RCs nisqakunaqa kikin detergente nisqawanmi wakichisqa kanku chaymi kikin efectota ruwanman. Rba nisqap kristal rikch'aynin. Sphaeroides RC co-cristalizado citocromo c2 (PDB ID: 1L9B) kaqwanpas huk wichqasqa QB sitioyuq hinam. Ichaqa, kay casopi, kay N-terminal región kay RC-M polipéptido kaqmanta (interactúa kay QB hukllanakuy sitiowan kay H enlace kaqninta kay Tyr residuo kaqmanta kay Q hélice kaqpi) huk mana natural conformación kaqta adoptan, chanta kay QB conformacional tikrayqa mana astawan mask’asqachu (30 ). Imachus sunqu tiyachiq kaqqa, mana kay laya deformación kay polipéptido M kaqmanta rikurqaykuchu kay RC-LH114-W estructura kaqpi, kaytaq yaqa kaqlla kay N-terminal región kaqwan kay RC-LH116 RC kaqmanta. Hinallatahmi qawarina, chay antena LH1 basada detergente nisqa chinkachisqa kaptin, PDB nisqapi apolipoproteína RC nisqakuna allichasqa kaptin, chaymi chinkachirqa chay piscinas de quinona interna nisqakunata chaynallataq lípidos nisqakunatapas chay RC nisqapa chawpinpi chaynallataq muyuriqninpi anillo LH1 nisqapa ukunpi kaq hawanpi (31, 32). RCqa llamk’aqllapuni kachkan imaraykuchus tukuy cofactores kaqta waqaychan, mana kay descomponible QB quinona kaqmantachu, kayqa aswan pisi takyasqa chanta sapa kuti chinkapun kay wakichiy ruwaypi (33). Chaymantapas, yachakun kay LH1 kaqmanta chanta kay lípidos cíclicos naturales kaqmanta RC kaqmanta hurquyqa huk impacto ruwayta atinman kay ruwaykunapi, kayhina kay pisiyachisqa kawsay kay carga-t’aqasqa P+QB-estado kaqmanta ( 31 , 34 , 35 ). Chayraykum, RC muyuriqpi LH1 anillo localpa kayninqa “wichqasqa” QB sitiota waqaychanman, chaywanmi QBpa hichpanpi llaqtapa pachamamanta waqaychanman.
Aunque apolipoproteína (mana QB quinona kaqwan) chanta kay hunt’asqa estructura iskay instantáneasllata rikuchinku kay QB sitiomanta turnover kaqmanta, aswanta huk serie eventos kaqmanta, kanmi indicaciones kay unión kaqta gated kayta atikunman kay hidroquinona kaqwan wakmanta hukllanakuyninta hark’anapaq Sustrato hark’ayta hark’anapaq. Kay interacción kay quinolol kaqwan kay quinona kaqwan kay apolipoproteína kaqpa QB kaqpa qayllanpi hukniraq kanman, kaytaq kay RC kaqwan rechazacionninman pusakun. Unaymantapachan yuyaykukun kay cambios conformacionales nisqakuna huk ruwayta ruwanku kay quinonas nisqakunaq hukllanakuyninpi hinallataq pisiyachiyninpipas. Kay atiy kay RCs congelados kaqmanta kay quinonas pisiyachiypaq kay tutayaq adaptación kaqmanta qhipaman mana allinchu kachkan (36); Cristalografía de rayos X rikuchin kay dañoqa kay quinonas QB kasqankurayku huk conformación “distal” kaqpi hap’isqa kasqankurayku yaqa 4,5 Å kay posición proximal activa kaqmanta (26) , 37). Sugeriyku kay conformación de unión distal huk instantánea kaqta kay estado intermedio kaqmanta kay apolipoproteína kaqwan kay estructura anillo hunt’a kaqwan, kaytaq qatin kay interacción inicialta kay quinona kaqwan chanta kay kichariy kay sitio QB kaqwan.
Kay tipo II RC tarisqa kay complejo PSII kaqpi wakin bacterias fototróficas kaqmanta chanta kay cianobacterias kaqmanta, algas kaqmanta chanta plantas kaqmanta kay conservación estructural chanta funcional kaqwan (38). Chay alineación estructural nisqa 6 (D y E) siqipim qawarisqa, chaymi aswanta qawarichin chay PSII RCs nisqawan chay sitio QB nisqawan chay complejo RC bacteriano nisqapa rikchakuyninta. Kay tupachiyqa unaymantapacha huk modelo karqa kay sistemas cercanos relacionados kay quinona watakuymanta chanta pisiyachiymanta yachaypaq. Ñawpaq qillqakuna yuyaycharqanku kay cambios conformacionales kaqwan kuska kasqankuta kay PSII reducción kaqwan kay quinonas kaqmanta ( 39 , 40 ). Chayraykum, RCpa evolutiva conservacionninta qawarispaqa, kay ñawpaq mana qawasqa mecanismo de unión nisqapas kanmanmi PSII RC nisqapa QB sitionmanpas, chay plantas fototróficas oxigenadas nisqapi.
Rps ΔpufW (mana etiquetada pufW deleción) chaymanta PufW-His (C-terminal 10x His-etiquetado proteína-W expresasqa kay natural pufW locusmanta) cepas. palustris CGA009 nisqamanta willakurqa ñawpaq llamkayniykupi ( 16 ). Kay cepas nisqakuna chaymanta isogénico sallqa tayta mamaqa congeladormanta kutichisqa karqan pisi yupay células nisqakunata PYE nisqapi (sapa 5 g litro -1) (LB nisqapi waqaychasqa -80 °C nisqapi, 50% ( p/v) glicerol) proteína nisqawan, levadura extracto nisqawan succinato nisqawan) agar [1,5% (p/v)] placa nisqapi. Chay placataqa huk tuta tutayaqpi temperatura ambiente nisqapi anaeróbico nisqapi incubarqunku, chaymantataq yuraq k’anchaywan (~50 μmolm-2 s-1) OSRAM 116-W bombillas halógenos nisqawan (RS Components, UK) 3manta 5 p’unchawkama k’ancharichirqanku, huklla colonia rikhurinankama. Huklla colonia nisqawanmi inoculakurqa 10 ml medio M22+ (41) nisqawan yapasqa 0,1% (p/v) casaminoácidos nisqawan (kaymantamantaqa M22 sutichasqa). Chay cultivo nisqatam wiñachirqaku pisi oxígeno nisqapi tutayaqpi 34°C nisqapi 180 rpm nisqapi 48 horata kuyuchispa, chaymantam 70 ml culturata inocularqaku chayna condicionkunapi 24 horas. Huk cultura semiaeróbica 1 ml volúmenniyuqmi 30 ml medio M22 nisqa 30 ml universal tornillo-top transparente vidrio botella nisqapi inoculanapaq, chaymantam irradiasqa agitaciónwan (~50μmolm-2 s-1) 48 horas fuerza magnética estéril nisqawan Vara de movimiento nisqawan. Chaymantaqa 30 ml cultivo nisqatam inocularqaku yaqa 1 litro cultivowan chayna condicionkunapi, chaymantam inocularqaku yaqa 9 litro cultivota ~200 μmolm-2 s-1 nisqapi k’ancharichisqa 72 horas. Chay células nisqakunatam pallarqaku centrifugacionwan 7132 RCF nisqapi 30 minuto, chaymantam ~10 ml 20 mM tris-HCl (pH 8.0) nisqapi kaqmanta suspendirqaku, hinaspam -20°C nisqapi waqaycharqaku necesitakunankama.
Descongelación nisqamantaqa, wakin cristales de desoxiribonucleasa I (Merck, Reino Unido), lisozima (Merck, Reino Unido) nisqamanta, iskay Roche holoenzima proteasa inhibidora tabletas nisqamanta (Merck, Reino Unido) nisqakunata yapay, chay resuspendida células nisqaman. 20.000 psi Franciamanta célula de presión nisqapi (Aminco, EE.UU.) células nisqakunataqa 8manta 12 kutitam ch’aqwarqanku. Mana pakisqa células nisqakunata, mana soluble nisqa q’upakunatapas centrifugacionwan 18.500 RCF nisqapi 15 minuto 4°C nisqapi hurquspa, membrana nisqatam precipitarqaku lisado pigmentado nisqamanta centrifugación nisqawan 113.000 RCF nisqapi 2 hora 43.000°C nisqapi. Chay fracción soluble nisqataqa wischuy hinaspa coloreado membranata 100manta 200 mlkama 20 mM tris-HCl (pH 8,0) nisqapi kaqmanta suspendispa homogeneizana mana rikukuq agregados kanankama. Chay membrana suspendida nisqatam 20 mM tris-HCl (pH 8.0) (Anatrace, EE.UU.) nisqapi 2% (p/v) β-DDM nisqayuqpi 1 hora tutayaypi 4°C nisqapi llampu kuyurichispa incubarqunku. Chaymantaqa 70°C nisqapi centrífuga nisqapi 150.000 RCF 4°C nisqapi 1 hora chullunanpaq, puchuq insolubles nisqakunata hurqunapaq.
Chay membrana solubilizante nisqa cepa ΔpufW nisqamanta churasqa karqan 50 ml columna de intercambio de iones DEAE Sepharose nisqaman, kinsa columna volúmenes nisqawan (CV) tampón de unión nisqawan [20 mM tris-HCl (pH 8.0) 0,03% (p / v) β-DDM nisqawan]. Columnataqa iskay tampones de unión CV nisqawan mayllana, chaymantataqmi mayllana columnata iskay tampón de unión nisqawan, 50 mM NaCl nisqayuq. Chay complejo RC-LH116 nisqatam 1,75 CV nisqapi 150manta 300 mM NaCl nisqa gradiente lineal nisqawan (tampón de unión nisqapi) chulluchirqaku, chaymantam puchuq complejo de unión nisqataqa 0,5 CV nisqapi 300 mM NaCl nisqayuq tampón de unión nisqawan chulluchirqaku. Huñuna espectro de absorción nisqa 250manta 1000 nmkama, chay fracción nisqa ratio de absorbancia nisqayuqta (A880/A280) 1manta aswan hatunta 880manta 280 nmkama waqaychay, iskay kutita diluina chay tampón de unión nisqapi, chaymantam yapamanta chayna ruwayta columna DEAE nisqapi On purification nisqapi. Chay fracciones nisqakunatam 1,7manta aswan hatun A880/A280 ratioyuqta, 3,0manta aswan hatun A880/A805 ratioyuqta diluy, kimsa kaq ronda intercambio de iones nisqa ruway, chaymanta fracciones nisqakunata waqaychana, A880/A280 ratios nisqa 2,2 nisqamanta aswan hatun, A880/A805 nisqa ratio 5,0 nisqamanta aswan hatun. Chay complejo parcialmente chuyanchasqaqa ~2 mlkamam concentrasqa karqa filtro centrífugo Amicon 100.000 peso molecular cut-off (MWCO) nisqapi (Merck, UK), hinaspam cargasqa karqa huk columna de exclusión Superdex 200 16/600 tamaño de exclusión nisqapi (GE Healthcare, US) 200 mM tampón NaCl nisqayuqpi, chaymantam eluido karqa kikin tampón nisqapi 1,5 CV nisqapi. Huñuna espectros de absorción nisqakunata chay fracción de exclusión de tamaño nisqamanta, chaymanta espectros de absorción nisqakunata A880/A280 nisqa ratiokunawan 2,4 nisqamanta aswanta huñuna, chaymanta A880/A805 nisqa ratiokunawan 5,8manta 100 A880 nisqamanta, chaymanta chaylla llamk’achiy crio-TEM rejilla wakichiypaq utaq waqaychaypaq -80°C nisqapi waqaychay necesitakunankama.
Chay cepa PufW-His nisqamanta membrana solubilizante nisqatam churarqaku 20 ml columna HisPrep FF Ni-NTA Sepharose nisqaman (20 mM tris-HCl (pH 8,0) 200 mM NaCl nisqawan 0,03% (p/p) nisqawan) tampón IMAC nisqapi ( GE Healthcare). v) β-DDM nisqa]. Chay columnata mayllakurqa pichqa CVs tampón IMACwan, chaymanta pichqa CVs tampón IMACwan 10 mM histidinayuq. Chay complejo núcleo nisqa columnamanta eluido karqa pichqa tampón IMAC nisqawan, chaypim 100 mM histidina nisqa karqa. Chay fracción nisqa complejo RC-LH114-W nisqayuqmi ~10 ml nisqakama concentrasqa kachkan huk tanque kuyurisqapi filtro Amicon 100.000 MWCO nisqawan equipasqa (Merck, UK), 20 kutita diluisqa tampón de unión nisqawan, chaymantam yapasqa 25 ml nisqaman Columna DEAE Sepharose nisqapiqa tawa CVs nisqakunatam tampón nisqaman watasqakunata ñawpaqmantaraq servichikunku. Mayllana columnata tawa tampón de unión CV nisqawan, chaymanta eluy chay complejo nisqa pusaq CVs nisqapi gradiente lineal nisqapi 0manta 100 mM NaCl nisqapi (tampón de unión nisqapi), chaymanta puchuq tawa CVs nisqapi 100 mM tampón de unión nisqawan Chay complejos residual eluidos nisqa cloruro de sodio nisqapi hukllawasqa chay relación A880/A280 nisqawan aswan hatun 2,4 nisqamanta chaymanta chay A880/A805 ratio aswan hatun 4,6 fracciones nisqamantaqa ~2 ml nisqamanmi concentrasqa karqa filtro centrífugo Amicon 100.000 MWCO nisqapi, hinaspam huntasqa karqa 1,5 CV IMAC nisqawan ñawpaqmantaraq Buffer equilibrated Superdex 200 16/600 tamaño de exclusión columna nisqapi, chaymantam eluido karqa kikin tampón nisqapi 1,5 CV nisqapi. Huñuna espectros de absorción nisqakunata chay fracciones tamaño-exclusión nisqamanta chaymanta concentrar chay espectros de absorción nisqakunata A880/A280 ratios nisqawan 2,1 nisqamanta chaymanta A880/A805 ratios nisqawan 4,6manta 100 A880 nisqamanta, chaykunatam chaylla llamkachinku congelado TEM rejilla wakichiypaq utaq waqaychanku -80°C nisqapi necesidadkama.
Chaypaqmi Leica EM GP congelador de inmersión nisqawanmi ruwakurqa pisi temperaturayuq TEM nisqa rejillas nisqakunata. Chay complejoqa diluido karqan tampón IMAC nisqapi A880 de 50 nisqaman, chaymantataq 5μl nisqa cargasqa karqan huk mosoq malla de cobre revestida de carbono QUANTIFOIL 1.2/1.3 nisqaman (Agar Scientific, UK). Chay rejillataqa 20°C nisqapi, 60% humedad relativa nisqapi ima 30 s incubana, chaymantataq 3 s ch’akichina, chaymantataq -176°C nisqapi etano líquido nisqapi wañuchina.
Chay complejo RC-LH114-W nisqapa willakuyninqa eBIC (Centro de Bioimagen Electrónico) (British Diamond Light Source) nisqapim qillqasqa karqa microscopio Titan Krios nisqawan, chaymi llamkan 300kV nisqa tension acelerador nisqapi, 130.000× nisqa hatunyachiy nominal nisqawan, chaynallataqmi- Akllay 20 eV nisqa brecha nisqawan. K2 pico detector nisqawan Gatan 968 GIF Quantum nisqawanmi yupaypi siq’ikunata qillqarqaku, chaywanmi willakuykunata huñurqaku. Kay pixel calibrado sayayninqa 1,048Å, chanta kay dosis tasa 3,83 e-Å-2s-1. Chay peliculata 11 segundosllapi huñuspa 40 partekunapi t’aqarqan. Carbonowan qatasqa cheqaswanmi microscopiota hukmanta enfocana, chaymantataq sapa t’oqopi kinsa peliculakunata huñuy. Llapanpiqa 3130 peliculakunam huñusqa karqa, defoco valores nisqakunam -1manta -3μmkama.
Chay complejo RC-LH116 nisqapaq willakuykunaqa huñusqam karqa kikin microscopio nisqawan Asterbury Biostructure Laboratory (University of Leeds, UK) nisqapi. Chay willakuykunaqa huñusqam yupay ruwaypi 130 k hatunyachiywan, chaymantam pixelpa sayayninqa 1,065 Åkama calibrasqa karqa 4,6 e-Å-2s-1 dosiswan. Chay peliculaqa 12 segundosllapin grabasqa karqan, 48 partekunapitaq t’aqasqa karqan. Llapanpiqa 3359 peliculakunam huñusqa karqa, chaymi valores de defoco nisqa -1manta -3μmkama.
Tukuy willakuy ruwayqa ruwakun Relion 3.0 gasoductopi (42). Motioncorr 2 (43) nisqawanmi viga nisqapa kuyuyninta allichana dosis ponderación nisqawan, chaymanta CTFFIND 4.1 (44) nisqawanmi CTF (función de transferencia de contraste) nisqa parámetro nisqa tarinapaq. Kay etapas de procesamiento inicial nisqamanta qipaman fotomicrografías típicas nisqakunam qawarichikun Figura 2. S16. Chay plantilla de selección automática nisqa ruwakun makiwan akllaspa yaqa 250 pixel 1000 partículas nisqamanta 250 pixel marco nisqapi hinallataq mana referencia iskay dimensional (2D) clasificación nisqawan, chaywanmi rechazakun chay clasificaciones nisqakuna, chaykunan tupan contaminación de muestra nisqawan utaq mana características discernibles nisqawan. Chaymantaqa, llapa microfotografía nisqakunapim ruwakurqa automática nisqa akllay, chaymantam RC-LH114-W nisqa 849.359 particulas nisqa, chaymanta complejo RC-LH116 nisqa 476.547 particulas nisqa. Llapan akllasqa particulakunam iskay muyuta ruwarunku mana referencia 2D nisqapi clasificacionta, sapa puriymantaqa, chay partículas nisqakunam chay área de carbono nisqawan tupan, contaminación de muestra, mana sutilla kaqkunapas nitaq sinchita superpuestos nisqa particulas nisqakunapas qipanchasqa, chaymi 772.033 (90,9%) hinaspa 359.678 (75,5%) ) Particulas nisqakunam 3D clasificación nisqapaqmi llamkachisqa kanku RC-LH114-W y RC-LH116 nisqakunam. Chay qallariy 3D referencia modelo nisqa ruwasqa karqan chay método de descenso de gradiente estocástico nisqawan. Qallariy modelo nisqawanmi referencia hina, akllasqa particulakunaqa tawa categoría nisqapi 3D nisqapi rakisqa kanku. Kay categoría nisqapi modelota referencia hina llamk’achispa, aswan hatun categoría nisqapi kaq particulakunapi 3D refinamiento nisqa ruway, chaymanta qallariy 15Å low-pass filtro nisqawan disolvente nisqa área nisqa tapanapaq, 6 pixel nisqa llampu kantukunata yapay, chaymanta pixel nisqakunata post-procesamiento nisqa ruway, chaynapi Gatan K2 pico Modulation nisqa transferencia nisqa ruwayta allichanapaq, chay pata detector nisqapa. RC-LH114-W willakuy huñupaqqa, kay qallariy modeloqa tikrasqam karqa mascarapa kantunkunapi sinchi densidadta hurquspa (UCSF Quimera nisqapi densidad compleja núcleo nisqamanta t’aqasqa). Chay ruwasqa modelos (RC-LH114-W y RC-LH116 nisqapa resolucionninkunam 3,91 hinaspa 4,16 Å, chayman hina) iskay kaq ronda de clasificación 3D nisqapaqmi referencia hina churakun. Chay particulakuna llamkachisqankuqa huñusqam kachkanku qallariy 3D clase nisqapi, chaymi mana sinchi correlacin nisqayuqchu barriowan. Sut’i rikukuq estructural nisqakunaq tupanakuynin utaq mana kaynin. Iskay kaq ronda 3D clasificación nisqamanta, aswan hatun resolución nisqayuq categoría nisqa akllasqa karqa [RC-LH114-W nisqapaqqa, huk categoría nisqa 377.703 particulas (44,5%), RC-LH116 nisqapaq, iskay categoría nisqakunam kachkan, llapanpiqa 260.752 particulas (54,7%) , Maypichus kaqlla kanku qallariy muyuchiymanta pisi chikanchasqa kaptinkulla]. Chay akllasqa particulakunataqa 400 pixel nisqa cajapi yapamanta hurqunku hinaspam 3D refinación nisqawan chuyanchanku. Chay disolvente mascaraqa qallariypi 15Å pisi pasaq filtrowan, 3 pixel mapa mastariywan hinaspa 3 pixel llampu mascarawan ruwasqa. Sapa particula CTF refinamiento nisqawan, sapa partícula kuyuy allichaywan chaymanta iskay kaq ronda sapa partícula CTF refinamiento nisqawan, 3D refinamiento, disolvente enmascarado chaymanta post-procesamiento nisqa ruwakun sapa llamkaymanta aswanta chuyanchanapaq chaymanta lluqsiq textura nisqa. FSC (Coeficiente de Correlación de Concha de Fourier) nisqawanmi 0,143 nisqa kuchusqa chaninchasqa, RC-LH114-W, RC-LH116 nisqapa tukupay modelonkunapa resolucionninkunaqa 2,65, 2,80Å, chayman hina. Chay tukupay modelopa kurva FSC nisqahmi qawarisqa kachkan 2. S17 siqipi.
Llapan secuencias proteicas nisqakunam UniProtKB nisqamanta uraykachisqa: LH1-β (PufB; UniProt ID: Q6N9L5); LH1-α (PufA; UniProtID: Q6N9L4) nisqamanta; RC-L (PufL; UniProt nisqap ID: O83005); RC-M (PufM; UniProt nisqap ID: A0A4Z7); RC-H (PuhA; UniProt nisqa ID: A0A4Z9); Proteína-W (PufW; ID UniProt: Q6N1K3) nisqa. SWISS-MODEL (45) nisqawanmi ruwakurqa RC nisqapa modelo de homología nisqa, chaypim kachkan RC-L, RC-M hinaspa RC-H nisqapa secuencias proteicas nisqapas chaynallataq Rba nisqapa estructura cristalina nisqapas. sphaeroides RC nisqaqa plantilla hina llamk’achikurqa (PDB ID: 5LSE) (46). Kay “mapa tupachiy” yanapakuyta UCSF Quimera kaqpi llamk’achiy kay ruwasqa modelota mapaman (47) tupachinapaq, allinchaypaq kay estructura proteica kaqmanta, chanta cofactor [4×BChl a (residuo biblioteca monómero suti = BCL), 2×BPh a (BPH), huk utaq iskay laya UQ10 (U10), huk hierro mana heme (Fe) chanta huk 3,4-dihidrohexacarbonilcolina (QAK)] Coot (48) nisqawan yapanapaq. QAK mana biblioteca monómero nisqapi kasqanraykum, parametrizasqa karqa PHENIX nisqapi herramienta eLBOW nisqawan ( 49 ).
Chaymantaqa, LH1 subunidad nisqatam ruwarqaku. Qallariypiqa, PHENIX (49) nisqapi automático ruway herramientawanmi kikillanmanta huk parteta ruwakurqa LH1 secuenciamanta mapawan chaynallataq LH1-α hinaspa LH1-β proteína secuenciakuna yaykuy hina. Aswan hunt’asqa LH1 subunidadta akllay, hurquspa Coot nisqaman cargay, makiwan chaypi faltaq secuenciata yapay, makiwantaq tukuy estructurata ch’uyanchana manaraq iskay BCls a (BCL) huk espirilloxantina (CRT) nisqatapas yapaspa [Rps relevante nisqaman hina Densidad del complejo LH1 nisqa chaymanta riqsisqa contenido carotenoide nisqa. Especies (17)). LH1 subunidad hunt’asqata copiay, hinaspa UCSF Quimera “Docking Map Tool” nisqawan LH1 densidadpa ladonpi mana modelo nisqa área nisqapi muelle ruwanapaq, chaymanta Coot nisqapi chuyanchay; chay ruwayta yapamanta ruwana llapa LH1 subunidades nisqakuna modelado kanankama. RC-LH114-W estructurapaqqa, Cootpi mana asignasqa densidadta hurquspaqa, chay proteína nisqa segmentakunmi puchuq mana proteína nisqa componentekunamanta USCF Chimera mapapi chaymantam Autobuild nisqa herramientawan churakun qallariy modelo nisqa sayarichinapaq, chaymanta puchuq subunidades (proteína-W) Modelado nisqa. FENIX (49) nisqapi. Ima secuencias faltasqatapas Coot (48) nisqapi ruwasqa modeloman yapay, chaymanta makiwan tukuy subunidadta chuyanchana. Puchuq mana asignasqa densidadqa tupanmi lípidos nisqakunapa huñunakuyninman (PDB monómero biblioteca ID de CDL = CDL, POPC = 6PL y POPG = PGT), β-DDM detergente (LMT) hinaspa UQ10 moléculas (U10). Coot (48) kaqpi PHENIX allinchayta (49) chaymanta makiwan allinchayta llamk'achiy, hunt'asqa qallariy modelota allinta ruwanapaq, chaymanta modelopa estadísticasnin chaymanta chay tupachiypa rikuy calidadnin mana aswan allinchasqa kanankama. Tukuchanapaq, LocScale (50) nisqawan llaqta mapata afilanapaq, chaymanta ruway huk achka ciclokunata mana asignasqa densidad nisqamanta modelado nisqamanta chaymanta automático chaymanta manual optimización nisqamanta.
Chay sapakama péptidos, cofactores chaymanta huk lípidos chaymanta quinonas atracados nisqakuna sapankanku densidadninku ukupi rikurinku Figuras 1 y 2. S18manta S23kama. Chay modelo final nisqapa willakuynin estadística nisqa qawarisqam kachkan Cuadro S1 nisqapi.
Mana huk nisqa kaptinqa, espectros de absorción UV/Vis/NIR nisqakunam huñusqa karqa espectrofotómetro Cary60 (Agilent, USA) nisqapi 1 nm intervalos nisqapi 250 nmmanta 1000 nmkama chaynallataq 0,1s integración nisqa pachawan.
Chay muestrataqa cubeta de cuarzo nisqapi 2 mm ñanniyuq A880 de 1 nisqaman diluy, hinaspa espectro de absorción nisqa 400manta 1000 nmkama huñuna. Chay espectros dicroicos circulares nisqakunam huñusqa karqa espectropolarímetro Jasco 810 (Jasco, Japón) nisqapi 1 nm intervalos nisqapi 400 nmmanta 950 nmkama 20 nm min-1 nisqapi escaneo nisqapi.
Chay coeficiente de extinción molar nisqataqa tarikunmi chay complejo núcleo nisqa A880 nisqaman yaqa 50. Diluir 10μl volúmen nisqa 990μl tampón de unión nisqapi utaq metanol nisqapi, chaymantam chaylla espectro de absorción nisqa huñuna, chaynapi BChl nisqapa degradación nisqa pisiyananpaq. Chay contenido de BChl nisqa sapa muestra de metanol nisqapiqa yupasqam karqa coeficiente de extinción nisqawan 771 nm nisqapi 54,8 mM-1 cm-1 nisqapi, chaymantam coeficiente de extinción nisqa tarikurqa ( 51 ). Chay tupusqa BChl nisqapa concentración nisqa 32 (RC-LH114-W) utaq 36 (RC-LH116) nisqawan rakina, chaywanmi yachakunqa chay concentración complejo de núcleo nisqa, chaymantam chay espectro de absorción nisqa chay kikin muestra huñusqa coeficiente de Extinción de tampón nisqapi tarinapaq. kuskapura. Sapa muestrapaqmi kimsa kuti kuti tupuykunata ruwakurqa, chaymantam yupanapaqqa absorbancia promedio nisqa BChl Qy máximo nisqapa ruwakuyninta ruwakurqa. Chay coeficiente de extincin nisqa RC-LH114-W tupusqa 878 nm nisqapiqa 3280±140 mM-1 cm-1, chaymanta coeficiente de extincin nisqa RC-LH116 tupusqa 880 nm nisqapiqa 3800±30 mM-1 cm-1.
UQ10qa (52) nisqapi ruwasqaman hinam yupasqa karqa. Pisi rimayllapi, HPLC de fase inversa (RP-HPLC) nisqa ruwakurqa Agilent 1200 HPLC sistema nisqawan. Yaqa 0,02 nmol RC-LH116 utaq RC-LH114-W nisqatam 50μl 50:50 metanol:cloroformo nisqapi 0,02% (p/v) cloruro férrico nisqayuqpi chulluchiy, chaymantam inyectan chay preequilibrado Beckman Coulter Ultrasphere ODS 4,6 mm Chulluchiy 1 ml-1 min-1 nisqapi 40°C HPLC nisqapi disolvente (80:20 metanol:2-propanol) nisqawan ×25 cm nisqa columnapi. Ruway elución isocrática nisqa disolvente HPLC nisqapi, chaywanmi qawarina absorbancia nisqa 275 nm (UQ10), 450 nm (carotenoides) hinaspa 780 nm (BChl) nisqapi 1 hora. Chay pico nisqa cromatograma 275 nm nisqapi 25,5 minutos nisqapiqa hukllawasqam karqa, chaypiqa manam huk compuestos detectables nisqapas karqachu. Chay área integrada nisqawanmi yupakun chay cantidad molar de UQ10 extraído nisqa chay curva de calibración nisqawan yupasqa chay inyección de normas puras nisqamanta 0manta 5,8 nmolkama (S14 siqi). Sapa muestra kimsa kuti kutipim qawarisqa, chaymantam willasqa pantayqa tupan chay promediopa SD nisqawan.
Huk solución mayqinchus complejo RC-LH1 kaqwan karqa huk absorción máxima Qy kaqwan 0,1 kaqwan wakichisqa karqa 30 μM pisiyachisqa caballo sunqu citocromo c2 kaqwan (Merck, Reino Unido) chanta 0manta 50 μMUQ2 kaqwan (Merck, Reino Unido). Kimsa 1-ml muestrakunam sapa UQ2 concentración nisqapi ruwasqa karqa hinaspam tutayaqpi 4°C nisqapi huk tuta incubasqa karqa, chaynapi manaraq tupuchkaspa tutayaqman huntasqa adaptacion kananpaq. Chay solución nisqatam cargarqaku espectrofotómetro modular OLIS RSM1000 nisqaman, chaymi equipasqa karqa 300 nm llama/500 linea rejilla nisqawan, 1,24 mm yaykuywan, 0,12 mm chawpiwan hinaspa 0,6 mm lluqsiy hendidurakunawan. Chay fototubo de muestra nisqapa yaykuyninpi chaynallataq tubo fotomultiplicador de referencia nisqapas 600 nm largo paso filtro nisqatam churanku, chaynapi excitación nisqa k’anchay mana kananpaq. Chay absorbancia nisqa qawarisqam 550 nm nisqapi 0,15 s integracin nisqa pachawan. Chay excitación k’anchayqa 880 nm M880F2 LED (Light Emitting Diode) (Thorlabs Ltd., Reino Unido) nisqamanta fibra óptica nisqa cable nisqawan 90% kallpawan DC2200 controlador nisqawan (Thorlabs Ltd., Reino Unido) lluqsimun, chaymantataq k’anchaypa paqariyninman 90° de. Chay tupuna vigaqa espejopa contranpim kachkan, chaynapi ima achkitapas kutichinanpaq, chay k’anchayqa qallariypiqa manam muestrapa chulluchisqachu karqa. Qhaway absorbanciata 10 s manaraq 50 s k’anchay kachkaptin. Chaymantaqa aswanta qhawasqa absorbanciata 60 s tutayaqpi chaninchanapaq maykamachus quinolol espontáneamente pisiyachin citocromo c23 + (qhaway Figura S8 crudo datospaq).
Chay datos nisqakunam ruwakurqa 0,5manta 10 skama ritmo inicial lineal nisqawan tupachispa (concentración UQ2 nisqamanta) chaynallataqmi promedio nisqapi kimsantin muestrakunapa tasas nisqakunata sapa concentración UQ2 nisqapi. Chay RC-LH1 nisqapa concentracin nisqa yupasqa chay coeficiente de extincin nisqawanmi chay tasa nisqa eficiencia catalítica nisqaman tikrasqa, chaymi Origin Pro 2019 (OriginLab, EE.UU.) nisqapi siq’isqa, chaymantam churasqa chay modelo Michaelis-Menten nisqaman, chaywanmi yachakun chay valores aparentes Km y Kcat nisqa.
Absorción transitoria tupuykunapaqqa, RC-LH1 muestraqa ~2μMkamam diluido karqa tampón IMAC nisqapi, chaypim karqa 50 mM ascorbato sódico (Merck, EE.UU.) hinaspa 0,4 mM Terbutina (Merck, EE.UU.) nisqa. Ácido ascórbico kaqqa huk sacrificio electron quq hina llamk’achisqa, chanta tert-butaclofeno huk QB hark’aq hina llamk’achisqa kay hatun RC quq pisiyachisqallapuni kananpaq (chayqa mana fotooxidadochu) tukuy tupuy ruwaypi. Yaqa 3 ml muestratam yapakun huk célula giratoria personalizada nisqaman (yaqa 0,1 m diámetro, 350 RPM) 2 mm óptico ñanpa largonwan, chaynapi chay muestra láser ñanpi suficiente tiempoyuq kananpaq yana adaptacionpaq pulsos de excitación nisqakunapura. ~100-fs pulsos láser nisqawanmi Ti: Sapphire láser sistema (Spectra Physics, USA) nisqa amplificanapaq, chaywanmi muestrata 880 nm nisqapi 1 kHz nisqa kuti-kutirispa (20 nJ NIR nisqapaq utaq 100 nJ Vis nisqapaq) kuyurichisun. Manaraq datos huñuchkaspaqa, muestra nisqatam yaqa 30 minuto excitación nisqa k’anchayman churana. Exposición kaqqa kay QA inactivación kaqta ruwanqa (ichapas huk kuti utaq iskay kutita QA pisiyachiy). Ichaqa ama hina kaspa kay ruwayqa kutichiy atiy kasqanmanta imaraykuchus unay pacha tutayaq adaptación nisqamanta, RC pisi pisimanta kutimunqa QA ruwayman. Espectrómetro Helios (Ultrafast Systems, USA) nisqawanmi espectro transitorio nisqakunata tupurqaku -10manta 7000 pskama tardanzawan. Surface Xplorer software (Ultrafast Systems, USA) llamk'achiy willay huñukunata mana huñunapaq, chaymanta hukllanapaq chaymanta estandarización ruwanapaq. CarpetView software paquete (Light Conversion Ltd., Lituania) llamk'achiy huñusqa willay huñuta llamk'achinapaq, ismuywan tupaq espectros diferenciales nisqakunata tarinapaq, utaq huk ruwayta llamk'achiy, mayqinchus achka exponentekunata instrumentu kutichiywan convolven, Origin (OriginLab, EE.UU.) nisqapi huklla onda espectral evolución nisqaman tupananpaq.
Imaynan ñawpaqpi nisqanchis hina (53), huk película fotosintética nisqa complejo LH1 nisqayoq mana iskaynin RC nisqayoq hinallataq periférico LH2 antena nisqayoqmi wakichisqa karqan. Chay membrana nisqatam 20 mM tris (pH 8,0) nisqapi diluirqunku, chaymantam cargarqaku cubeta de cuarzo nisqaman, 2 mm nisqa ñan óptico nisqawan. 30nJ pulso láser nisqawanmi muestrata excitarqaku 540 nm nisqapi -10manta 7000 pskama tardanzawan. Rps nisqapaq willakusqanman hina willakuy huñusqata ruway. pal muestra.
Chay membrana nisqatam centrifugacionwan 150.000 RCF nisqapi 2 hora 4°C nisqapi pelletarqaku, chaymantam 880 nm nisqapi absorbancianta 20 mM tris-HCl (pH 8,0) hinaspa 200 mM NaCl nisqapi musuqmanta suspendirqaku. Chay membranata chulluchiy, 2% (p/v) β-DDM nisqapi 1 hora tutayaqpi 4°C nisqapi pisi pisimanta kuyurichispa. Chay muestraqa 100 mM carbonato de trietilamonio (pH 8,0) (TEAB; Merck, UK) nisqapim diluido karqa, chaymi 2,5 mg ml-1 proteico nisqa (análisis Bio-Rad). Aswan procesamiento ruwakurqa ñawpaq publicasqa métodomanta (54), qallarirqa dilución 50 μg proteína tukuyninpi 50 μl TEAB kaqpi 1% (p/v) laurato sódico kaqwan (Merck, Reino Unido). 60 s sonicación ruwasqamanta, 5 mM tris (2-carboxetil) fosfina (Merck, UK) 37 ° C 30 minutos pisiyachisqa karqa. S-alquilación nisqapaqqa, muestra nisqatam 10 mM metil S-metiltiometanosulfonato (Merck, UK) nisqawan incubarqusun, hinaspam 200 mM isopropanol stock solución nisqamanta 10 minuto temperatura ambiente nisqapi yapaykusun. Digestión proteolítica nisqa ruwakurqa 2 μg tripsina/endoproteína Lys-C mezcla (Promega UK) nisqawan yapaspa, 37°C nisqapi 3 horas incubasqa. Chay laurato tensioactivo nisqatam hurqurqaku 50 μl acetato de etilo nisqawan 10 μl 10% (v/v) ácido trifluoroacético LC grado (TFA; Thermo Fisher Scientific, UK) nisqawan yapaspa, 60 s vortex nisqawan. Chay fase rakiyqa centrifugación nisqawanmi 15.700 RCF nisqapi 5 minutos nisqapi kallpanchasqa karqa. Ruwaqpa protocolonman hinaqa, C18 columna de espin (Thermo Fisher Scientific, Reino Unido) nisqawanmi allinta aspirasqa hinaspa kachita hurqurqaku chay péptido nisqa uray fase nisqapi. Centrifugación de vacío nisqawan ch’akichisqamantaqa, muestraqa 0,5% TFA nisqapi, 3% acetonitrilo nisqapi ima chulluchisqa, 500 ng nisqataqmi analizasqa karqan cromatografía RP nanoflujo nisqawan kuskachasqa espectrometría de masas nisqawan, chaypaqmi utilizakun parámetros del sistema nisqa ñawpaq detallada nisqawan.
Kay MaxQuant v.1.5.3.30 (56) kaqwan kay proteína riqsichiypaq chanta kay cuantificación kaqpaq kay Rps mask’anapaq. palustris proteoma nisqamanta willakuy (www.uniprot.org/proteomas/UP000001426). Kay espectrometría de masas proteómica nisqamanta willakuykunaqa ProteomeXchange Alliance nisqapi churasqa kachkan kay PRIDE socio waqaychasqa kaqnintakama (http://proteomecentral.proteomexchange.org) kay willakuy huñu riqsichiq PXD020402 nisqawan.
Análisis RPLC nisqawan kuskachasqa espectrometría de masas de ionización electrospray nisqawanmi, chay complejo RC-LH1 nisqa sallqa Rps nisqamanta wakichisqa karqan. Ñawpaq qillqasqa ruwaywan (16), kay concentración proteica ruwasqa kay células palustris kaqpi karqa 2 mg ml-1 kay 20 mM Hepes (pH 7,8), 100 mM NaCl chanta 0,03% (p/v) β- (análisis Bio-Rad) ) DDM kaqpi. Chay ruwaqpa protocolonman hinaqa, kit de purificación 2D (GE Healthcare, EE.UU.) nisqawanmi 10 μg proteína nisqa hurquna método de precipitación nisqawan, chaymanta chay precipitado nisqataqa 20 μl 60% (v / v) ácido fórmico (FA), 20% (v / v) acetonitrilo hinaspa 20% (v/v) yakupi chulluchina. Pichqa microlitrokunatam qawarirqaku RPLC (Dionex RSLC) nisqawan espectrometría de masas nisqawan (Maxis UHR-TOF, Bruker) nisqawan kuskachasqa. MabPac 1,2×100 mm columna (Thermo Fisher Scientific, Reino Unido) nisqawanmi 60°C nisqapi hinaspa 100μlmin -1 nisqapi rakinapaq, gradiente nisqawan 85% (v / v) disolvente A [0,1% (v / v) FA nisqawan 0,02% (V/v) TFA yaku solución] nisqawan 85%(v/v) disolvente B nisqawan [0,1%(v/v) FA y 0,02%(v/v) 90%(v/v) acetonitrilo TFA nisqapi] Fuente de ionización electrospray estándar nisqawan chaymanta parámetros predeterminados nisqawan aswan 60 minutos nisqapi, espectrómetro de masas nisqa 100manta 2750 m/zkama (ratio masa-carga) nisqatam tarin. ExPASy bioinformática recurso portal FindPept yanapakuypa yanapayninwan (https://web.expasy.org/findpept/), espectro masivo nisqa complejo nisqapi subunidades nisqaman mapapi.
Chay células nisqakunatam wiñachirqaku 72 horas 100 ml NF-pisi (10μMm-2 s-1), chawpi (30μMm-2 s-1) utaq hatun (300μMm-2 s-1) k’anchaypi. M22 medio (M22 medio maypichus sulfato de amonio nisqa saqisqa kachkan, succinato sódico nisqataq acetato sódico nisqawan tikrasqa kachkan) 100 ml tornillo patayuq botellapi (23). Pichqa 30-s ciclokunapim, 0,1 micras vidriomanta perlaskunata perlaswan 1:1 ratio de volumen nisqapi celulakunata lisisanankupaq, chaymantam hielopi 5 minuto chiriyachirqaku. Chay mana chulluq materia, mana pakisqa células nisqakunata, vidriomanta perlas nisqakunatapas hurqurqakum centrifugación nisqawan 16.000 RCF nisqapi 10 minuto microcentrífuga de banco nisqapi. Chay membrana nisqa t’aqasqa karqan Ti 70.1 rotor nisqapi 100.000 RCF nisqawan 20 mM tris-HCl (pH 8,0) nisqapi 40/15% (p/p) gradiente de sacarosa nisqawan 10 horas.
Imaynatachus ñawpaq llamk’ayniykupi willakurqa, inmunodetección kay etiqueta His kaqmanta kay PufW kaqpi ( 16 ). Pisi rimayllapi, chay complejo núcleo purificado (11,8 nM) utaq chay membrana kaqlla concentración RC nisqayuq (determinasqa oxidación nisqawan qichuspa espectro de diferencia reducido nisqawan chaymanta tupachispa carga nisqawan chay gel tintado nisqapi) 2x tampón de carga SDS nisqapi (Merck, UK) iskay kutita diluido nisqapi. Chay proteínas nisqakunam rakisqa karqa huk replica 12% bis-tris NuPage gel (Thermo Fisher Scientific, Reino Unido) nisqapi. Huk gel nisqatam Coomassie Brilliant Blue (Bio-Rad, Reino Unido) nisqawan tintarqaku, chaynapi RC-L subunidad nisqa cargakunanpaq hinaspa qawachinapaq. Iskay kaq gel nisqapi kaq proteína nisqatam inmunoensayo nisqapaq fluoruro de polivinilideno activado por metanol (PVDF) nisqaman (Thermo Fisher Scientific, UK) aparqaku. Chay membrana PVDF nisqatam harkarqaku 50 mM tris-HCl (pH 7,6), 150 mM NaCl, 0,2% (v / v) Tween-20 hinaspa 5% (p / v) leche desnatada polvo nisqapi, chaymantam incubarqurqaku anticuerpo primario anti-His nisqawan (in Diluir el tampón de anticuerpos [50 mM tris-HCl (pH 7,6), chaypim incubarqunku, 150 mM NaCl y 0,05% (v/v) Tween-20] 1:1000 A190-114A, Bethyl Laboratories, EE.UU.) nisqapi 4 horas. 3 kutita 5 minuto tampón anticuerpo nisqapi mayllasqa kaptin, membranata hukllawarqaku peroxidasa de rábano (Sigma-Aldrich, Reino Unido) anticuerpo secundario de ratawan (diluido 1:10.000 tampón anticuerpo nisqapi) Incubasqam detección kananpaq (5 minuto 3 mayllasqamanta tampón anticuerpo nisqapi) sustrato de quimiluminescencia WESTAR ETA C 2.0 nisqawan (Cyanagen, Italia) chanta Amersham Imager 600 (GE Healthcare, Reino Unido) kaqwan ima.
Sapa gel tintado utaq carril inmunoensayo nisqapa intensidad rakiyninta siq’ispa, pico urapi kaq áreata hukllawaspa chaymanta RC-L (gel tintado) chaymanta Proteína-W (inmunoensayo) nisqapa intensidad ratio nisqa yupaspa, ImageJ (57) nisqapi Imahinata ruway. Kay ratios nisqakunam tikrasqa karqa ratios molares nisqaman, suyaspa chay ratio RC-Lmanta proteína-Wmanta chay chuya RC-LH114-W muestrapi 1:1 kasqanmanta chaymanta normalizaspa llapan conjunto de datos nisqa chayman hina.
Kay qillqasqapaq yapasqa materialkunapaq, ama hina kaspa qhaway http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1
Kayqa kichasqa yaykuy qillqam, Creative Commons Attribution License nisqap kamachiyninkunaman hina rakisqa. Chay qillqasqaqa mana harkasqa llamk'achiyta, rakiyta, mirachiyta ima mediopipas saqillan, ñawpaq llamk'ay allinta citasqa kaptin.
Qhaway: Correo electrónico direccionniyki qunaykipaqlla mañaykiku chaymanta chay p'anqaman yuyaychasqayki runa yachanqa chay correo electrónico rikunankuta munasqaykita chaymanta mana spam kaqta. Manam ima correo electrónico direccionkunatapas hapisaqkuchu.
Kay tapuyqa watukuq kasqaykita pruebanapaq chaymanta kikillanmanta spam apachiyta hark'anapaq llamk'achkan.
David J. K. Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Chakra llamk'aq, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P Canniffe , Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirmaier, Andrew Hitchcock, C. Neil Hunter
Chay hatun resolución nisqa estructura nisqa chay complejo de trampa 1 de reacción nisqapiqa musuq hamutaykunatam qun chay dinámica de quinona nisqamanta.
David J. K. Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Chakra llamk'aq, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P Canniffe , Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirmaier, Andrew Hitchcock, C. Neil Hunter
Chay hatun resolución nisqa estructura nisqa chay complejo de trampa 1 de reacción nisqapiqa musuq hamutaykunatam qun chay dinámica de quinona nisqamanta.
©2021 Asociación Americana para el Avance de la Ciencia nisqa. tukuy hayñikuna waqaychasqa. AAAS nisqaqa HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef hinaspa COUNTER nisqakunapa yanapaqninmi. CienciaAvances ISSN 2375-2548 nisqapi.