Kunan *Kunan direccion: Colonia 50931, Alemania, Colonia Excelencia Cluster Investigación kaqmanta kay Respuesta kay Estrés Celular kaqmanta kay Enfermedadwan tupaq unquykunapi (CECAD).
Kay neurodegeneración kay mitocondrial unquykunamanta mana kutichiy atikuq hina qhawasqa imaraykuchus kay plasticidad metabólica kay neuronas kaqmanta pisilla, ichaqa kay efectota kay disfunción mitocondrial kaqmanta kay autonomía celular kaqpi kay metabolismo neuronal kaqmanta kay kurkupi mana allintachu yachakun. Kaypi, riqsichiyku kay proteoma celular-específico kay Purkinje neuronas kaqmanta kay progresiva OXPHOS pisiyaywan kay disrupto dinámica de fusión mitocondrial kaqwan. Taparqayku kay disfunción mitocondrial huk ukhu tikrayta kay proteómica kaqpi llamk’achisqanmanta, qhipaman pusarqa kay activación secuencial kaqman kay programas metabólicos precisos kaqmanta manaraq kay células wañuchkaptin. Mana suyasqa hina, determinarqayku sut’i inducción piruvato carboxilasa (PCx) kaqmanta huk peroxidasas kaqmanta kay TCA ciclo intermedios suplementación kaqwan tupaq. Kay PCx hark’ayqa aswanta yaparqa kay estrés oxidativo kaqmanta chanta kay neurodegeneración kaqmanta, kaytaq rikuchirqa kay aterosclerosis huk hark’aq ruwayniyuq kaqta kay neuronas mana OXPHOS kaqwan. Kay fusión mitocondrial kaqmanta kutichiy kay neuronas terminalmente degeneradas kaqpi tukuyninpi kay características metabólicas kaqta kutichin, kaywantaq hark’an kay células wañuyta. Kay tarisqaykuqa riqsichin ñawpaq mana riqsisqa ñankunata mayqinkunachus resistenciata qun kay disfunción mitocondrial kaqman chanta rikuchin kay neurodegeneración kaqta kutichiy atikunman kay unquypa qhipa etapas kaqpipas.
Kay mitocondrias kaqpa chawpi ruwaynin kay metabolismo energético neuronal kaqta waqaychaypi aswanta kallpachasqa kachkan kay hatun neurológicos síntomas kaqwan kay runap mitocondriales unquykunawan hukllachasqa kaqwan. Yaqa llapan kay unquykuna kay mutaciones génicas kaqwan ruwasqa kanku mayqinkunachus kay expresión génica mitocondrial kaqwan (1, 2) utaq kay gen chinkachiywan tupaq kay dinámica mitocondrial kaqwan, kaytaq indirectamente afectan kay estabilidad kay ADN mitocondrial kaqwan (ADNmt) (3, 4). Llamk’ay kay uywa modelos kaqpi rikuchirqa kay disfunción mitocondrial kaqman kutichiypi kay muyuriq tejidos kaqpi, kay conservadoras vías metabólicas (5-7) activados kankuman, kayhinamanta huk importante qhawaykunata kay patogénesis kaqmanta kay complejas unquykunamanta qun. Kay sinchi chiqanpi, kay entiendesqayku kay cambios metabólicos kaqmanta kay tipos celulares específicos kaqmanta kay fracaso general kaqmanta kay cerebro mitocondrial adenosina trifosfato (ATP) ruwaymanta ruwasqa kaqqa fundamental (8), kay necesidadta riqsichispa kay metas terapéuticas kaqta kay unquyta hark’anapaq utaq hark’anapaq llamk’achiyta atikunman. Neurodegeneración nisqamanta hark’akuy (9). Kay mana willakuy kasqanqa kay células nerviosas kaqqa anchata qhawasqa kanku ancha pisi flexibilidad metabólica kaqwan kay tipos celulares kaqwan tupachisqa kay muyuriq tejidos kaqwan ( 10 ). Kay células huk central ruwayta ruwanku kay coordinación kaqpi kay metabolitos suministro kaqta kay neuronas kaqman kay transmisión sináptica kaqta kallpachanankupaq chanta kay k’irisqaman chanta kay unquykunaman kutichinankupaq, kay atiy kay metabolismo celular kaqta kay sasachakuy condiciones kaqman kay cerebro tejido kaqmanta adaptayta yaqa kay células gliales kaqllapi (11-14). Chaymantapas, kay heterogeneidad celular inherente kay tejido cerebral kaqmanta aswanta hark’an kay estudiota kay cambios metabólicos kaqmanta mayqinkunachus ruwakunku kay subgrupos neuronales específicos kaqpi. Chayrayku, pisillata yachakun kay consecuencias celulares chanta metabólicas exactas kaqmanta kay disfunción mitocondrial kaqmanta kay neuronas kaqpi.
Kay consecuencias metabólicas kaqmanta kay disfunción mitocondrial kaqmanta hamut’anapaq, kay neuronas Purkinje (PNs) kaqmanta t’aqarqayku kay neurodegeneración kaqmanta hukniray etapas kaqpi kay fusión de membrana exterior mitocondrial (Mfn2) chinkachisqa kasqanrayku. Aunque kay Mfn2 mutaciones kay runakunapi huk forma kay neuropatía sensorial motora hereditaria kaqwan riqsisqa kanku kay Charcot-Marie-Tooth tipo 2A kaqwan (15), kay condicional chinkachiy kay Mfn2 kaqmanta kay chupakunapi huk allin riqsisqa inducción kay oxidación Fosforilación (OXPHOS) disfunción método kaqwan. Kay imaymana subtipos neuronales (16-19) chanta kay fenotipo neurodegenerativo kaqmanta lluqsiq sintomas neurológicos progresivos kaqwan kuska kanku, kayhinata kay trastornos de movimiento kaqwan ( 18 , 19 ) utaq kay ataxia cerebelosa kaqwan ( 16 ). Huk huñusqa proteómica cuantitativa (LFQ) mana etiquetayuq, metabolómica, imajinas, chanta virológicos métodos kaqwan, rikuchiyku kay progresiva neurodegeneración sinchita induce kay piruvato carboxilasa (PCx) kaqmanta chanta wak factores involucrados kay arteriosclerosis kaqpi kay PNs kaqmanta in vivo Kay expresión de enzimas kaqmanta. Kay tariypa relevancianta chiqaqchanapaq, específicamente urayman regularqayku kay expresión kay PCx kaqmanta kay Mfn2-deficientes PNs kaqpi, chanta tarirqayku kay operación kay estrés oxidativo kaqmanta aswanta yapasqanmanta chanta kay neurodegeneración kaqta usqhaylla ruwasqa kaqta, kayhinata pruebaspa kay azoospermia wañuy celular kaqta qun adaptabilidad metabólica kaqmanta. Kay sinchi expresión kay MFN2 kaqmantaqa tukuyninpi qispichinman kay terminal degeneración PN kaqwan kay sinchi OXPHOS pisiyaywan, kay hatun mikhuywan kay ADN mitocondrial kaqwan, chanta kay rikch’akuq p’akisqa llika mitocondrial kaqwan, kaytaq aswanta enfatiza kay forma kay neurodegeneración kaqmanta kay etapa ñawpaqman purisqa unquypi manaraq wañuy células kaqpi.
Kay mitocondrias kaqta Mfn2 knockout PNs kaqpi qhawanapaq, huk cepa de rata kaqwan llamk’arqayku, mayqinchus Cre-dependiente mitocondrias kaqta q’illu fluorescente proteína (YFP) (mtYFP) (20) Cre expresión kaqman targetta ruwayta atin chaymanta kay mitocondrial morfología in vivo kaqpi qhawarqayku. Taparqayku kay PNs kaqpi kay Mfn2 gen chinkachiyqa kay llika mitocondrial pisi pisimanta t’aqakuyninman apayta atinman ( Figura S1A ), chanta aswan ñawpaq tikrayqa tarikurqa 3 semanas edadniyuqpi. Kay contraste kaqpi, kay sustancial degeneración kay capa celular PN kaqmanta, kay Calbindin inmunotinción chinkachiywan rikuchisqa hina, mana qallarirqachu 12 semanas edadniyuqkama ( Figura 1, A chanta B ). Kay pacha mana tupachiy kay ñawpaq tikrakuykuna kay morfología mitocondrial kaqpi chanta kay rikukuq qallariy neuronal wañuywan kallpachawarqayku kay metabólicos tikrakuykuna kay disfunción mitocondrial kaqwan qallarisqa manaraq célula wañuchkaptinku investiganaykupaq. Ruwarqayku huk estrategia fluorescencia-activada celular clasificación (FACS)-basado YFP (YFP +)-expresador PN t’aqanapaq (Figura 1C), hinallataq control chupakunapi (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre), kaymanta CTRL (S1B siqi). Kay optimización kay estrategia gating kaqmanta kay relativa intensidad kaqpi kay señal YFP kaqmanta permite chuyanchayta kay YFP+ cuerpo (YFPhigh) kaqmanta kay PNs kaqmanta kay mana PNs kaqmanta (YFPneg) (S1B siqi) utaq putativo axón fluorescente/fragmentos dendríticos kaqmanta (YFPlow; Figura S1D, lluq'i), microscopio confocal kaqwan chiqanchasqa (S1D siq'i, paña). Kay identidad kay población clasificada kaqmanta chiqaqchanapaq, ruwarqayku proteómica LFQ kaqmanta chaymanta análisis de componentes principales kaqmanta, chaymanta tarirqayku huk sut’i t’aqanakuy kaqta kay células YFPhigh chanta YFPneg kaqwan ( Figura S1C ). YFPhigh células rikuchirqanku huk llika qhapaqyachiyta riqsisqa PNs marcadores kaqmanta (kayhina Calb1, Pcp2, Grid2 chanta Itpr3) (21, 22), ichaqa mana qhapaqyachiyta kay proteínas kaqmanta comúnmente expresasqa neuronas kaqpi utaq wak laya celulares kaqpi (Figura 1D) ). Huk tupachiy muestrakuna clasificasqa YFPhigh células huñusqa independiente experimentokuna rikuchirqa huk coeficiente de correlación> 0,9, rikuchispa allin reproducibilidad replicados biológicos (Figura S1E). Resumenpi, kay datos validarqanku planniykumanta aislamiento agudo chaymanta específico kaqpaq kay PN factible kaqmanta. Imaraykuchus kay L7-cre conductor sistema llamk’achisqa induce recombinación mosaico kaqta kay ñawpaq semanapi kay parto kaqmanta (23), qallarirqayku culling chupakunata kay CTRL kaqmanta chanta condicional kaqmanta (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) Huñuy neuronas kaqmanta. Recombinación tukusqa kaptin, 4 semanas watayuq kachkaspa Mfn2cKO sutichasqa. Punto final hina, akllarqayku 8 semanas edadniyuqta maypachachus capa PN mana imayuqraq karqa sut’i fragmentos mitocondriales kaqtinpas ( Figura 1B y Figura S1A). Llapanpiqa, llapanpiqa 3013 proteínakunatam yuparqaniku, chaymantam yaqa 22% MitoCarta 2.0 anotacionkunapi proteoma mitocondrial nisqapi mitocondrias hina (1E siqi) (1E siqi) (24). Kay análisis de expresión génica diferencial ruwasqa 8 semanapi rikuchirqa 10,5%lla tukuy proteínasmanta hatun tikrayniyuq kasqankuta ( Figura 1F chaymanta Figura S1F), chaymanta 195 proteínas urayman regulasqa karqanku chaymanta 120 proteínas wichayman regulasqa karqanku ( Figura 1F). Kayqa allinmi kay “análisis de vías innovadoras” kay conjunto de datos kaqmanta rikuchin kay genes diferencialmente expresados ​​principalmente pertenecen kay conjunto restringido kaqmanta kay vías metabólicas específicas kaqmanta (Figura 1G). Interesante kaq, aunque kay down-regulación kay ñankunamanta kay OXPHOS kaqwan chanta kay señalización calcio kaqwan tupaq kay inducción kay disfunción mitocondrial kaqmanta kay PNs deficientes de fusión kaqpi chiqanchakun, huk categorías kaqkuna mayqinkunachus aswanta kay metabolismo aminoácidos kaqwan involucranku, kayqa anchata wichayman regulasqa kanku, kaytaq kay metabolismo kaqwan huklla kachkan mayqinchus kay PNs mitocondriales kaqpi ruwakun. Recableadoqa sapa kutim. mana llamk’ay.
(A) Representante fotografías confocales kay secciones cerebelosas kaqmanta kay CTRL chanta Mfn2cKO chupakunamanta rikuchispa kay progresiva chinkachiy kay PNs kaqmanta (calbindina, gris); núcleos nisqakunam contratintasqa karqa DAPI nisqawan. (B) Cuantificación de (A) (análisis de varianza huk ñanllamanta, ***P<0.001; n = 4manta 6 muyukama kimsa chupakunamanta). (C) Experimental llamkay puririynin. (D) Purkinjepaq específico nisqa marcadores nisqapa mapa térmico nisqapa rakikuynin (hanaypi) huk tipos de células nisqapahpas (chawpi). (E) Venn diagrama rikuchiq hayk’a proteínas mitocondriales riqsisqa kay PN clasificado kaqpi. (F) Grafico volcánico nisqamanta proteínas diferencialmente expresadas nisqamanta neuronas Mfn2cKO nisqapi 8 semanas nisqapi (valor de corte de significación 1,3). (G) Kay anlisis de creatividad ñanqa rikuchin pichqa aswan importante up-regulación (puka) chanta down-regulación (azul) ñankunata kay Mfn2cKO PN kaqpi clasificasqa 8 semanas kaqpi. Sapa tarisqa proteína nisqapa nivel de expresión promedio nisqa qawarichikun. Gris ruphay mapa: P chaninchasqa allichasqa. ns, mana importantechu.
Proteómica nisqamanta willakuykunaqa qawarichirqakum complejos I, III, IV nisqapa expresión proteica nisqa pisi pisimanta pisiyasqanmanta. Complejos I, III, IV llapanku subunidades esenciales codificadas ADNmt kaqwan karqanku, complejo II kaqtaq, mayqinchus codificados nucleareslla karqa, básicamente mana afectasqachu karqa ( Figura 2A chanta Figura S2A). . Kay proteómica ruwasqakunawan kuska, inmunohistoquímica kay cerebelosa tejido secciones kaqmanta rikuchirqa kay MTCO1 (mitocondrial citocromo C oxidasa subunidad 1) subunidad nivel kay complejo IV kaqmanta kay PN kaqpi pisi pisimanta pisiyasqanmanta ( Figura 2B ). Kay mtDNA-codificado subunidad Mtatp8 anchata pisiyachisqa karqa ( Figura S2A), chaymanta kay nivel de estado estacionario kay nuclear-codificado ATP sintasa subunidad kaqmanta mana tikrasqachu karqa, kaytaq huklla kachkan kay riqsisqa estable ATP sintasa submontaje F1 complejo kaqwan mayk’aqchus mtDNA expresión estable kachkan. Chay formacionqa mana kaqllachu. Interrupción (7). Chaninchaynin kay nivel de ADNmt kaqmanta kay ordenado Mfn2cKO PNs kaqpi kay reacción en cadena de polimerasa kaqmanta chiqa pacha (qPCR) kaqwan chiqanchakurqa kay pisi pisimanta pisiyayninta kay ADNmt copia yupaypi. Kay control qutuwan kikinchasqa, 8 semanas watayuq kachkaspa, yaqa 20% kaqlla kay nivel de ADNmt kaqmanta Was retenido (Figura 2C). Kay ruwasqakunawan kuska, kay microscopía confocal tinción kay Mfn2cKO PNs kaqmanta ADN riqsinanpaq rikuchin kay pachamanta dependiente mikhuy kay nucleótidos mitocondriales kaqmanta ( Figura 2D ). Taparqayku wakin candidatoslla involucrados kay degradación proteica mitocondrial kaqpi chanta kay estrés kutichiypi kaqkuna up-regulados kasqankuta, kay Lonp1, Afg3l2 chanta Clpx kaqwan, chanta kay factores complejos montaje OXPHOS kaqwan ima. Mana huk hatun tikrakuykuna tarikurqachu kay niveles de proteínas involucradas kay apoptosis kaqpi (Figura S2B). Chaynallataqmi tarirqayku mitocondrias nisqapas, canales de retículo endoplásmico nisqapas, calcio nisqapa transporte nisqapi kaqkunapas, pisilla cambiokunayuq kasqankuta (S2C siqi). Hinallataq, kay chaninchay kay autofagia kaqwan tupaq proteínas kaqmanta mana tarirqachu huk hatun tikraykunata, kaytaq huklla kachkan kay rikukuq inducción kaqwan kay autofagosomas kaqmanta kay in vivo kaqpi qhawasqa kay inmunohistoquímica kaqwan chanta kay microscopía electrónica kaqwan ( Figura S3 ). Ichaqa, kay progresiva disfunción OXPHOS kaqwan kay PNs kaqpiqa sut’i cambios mitocondriales ultraestructurales kaqwan kuska kachkan. Clusteres mitocondriales nisqakunam rikukunman cuerpos celulares nisqapi chaynallataq dendríticos sachakunapipas Mfn2cKO PNs nisqapi 5 hinaspa 8 semanayuq, chaymantam estructura de membrana interna nisqapiqa hatun cambiokuna karqa (Figura S4, A y B). Kay ultraestructural tikrakuykunawan tupaq hinallataq huk ancha pisiyay ADNmt nisqapi, análisis de rebanadas agudas cerebelares cerebelosas nisqamanta tetrametilrodamina metil éster (TMRM) nisqawan qawarichirqa chay potencial de membrana mitocondrial nisqa Mfn2cKO PNs nisqapi anchata pisiyasqanmanta ( Figura S4C ).
(A) Análisis de curso de tiempo nisqamanta nivel de expresión nisqamanta complejo OXPHOS nisqamanta. P<0,05 kaqwan proteínas kaqllata qhawarina 8 semanas kaqpi (iskay ñan ANOVA). Punto chiru: CTRL nisqawan tupachisqaqa manam allinchakuychu. (B) Lloq’e: Huk ejemplo huk sección cerebelosa nisqamanta, anticuerpo anti-MTCO1 nisqawan etiquetasqa (barra de escala, 20 μm). Purkinje células nisqa kurkukunap tiyasqan suyuqa q'illuwan qatasqa kachkan. Paña: Cuantificación de niveles de MTCO1 (análisis de varianza huk ñanmanta; n = 7manta 20kama células analizadas kimsa chupakunamanta). (C) análisis qPCR kaqmanta kay mtDNA copia yupaymanta kay PN clasificado kaqpi (análisis de varianza huk ñanmanta; n = 3 kaqmanta 7 chupakunamanta). (D) Lloq’e: Huk ejemplon huk rebanada cerebelosa nisqamanta, anticuerpo anti-ADN nisqawan etiquetasqa (barra de escala, 20 μm). Purkinje células nisqa kurkukunap tiyasqan suyuqa q'illuwan qatasqa kachkan. Paña: Cuantificación de lesiones de ADNmt (análisis de varianza huk ñanllamanta; n = 5manta 9kama células kimsa chupakunamanta). (E) Huk ejemplo huk sección cerebelosa aguda kaqmanta rikuchiq células mitoYFP + Purkinje kaqmanta (flecha) huk grabación abrazadera parche entera célula kaqpi. (F) Curva IV nisqapa yupaynin. (G) Grabaciones representativas kay inyección de corriente despolarizante kaqmanta kay células CTRL chanta Mfn2cKO Purkinje kaqpi. Pata rastro: Ñawpaq pulso APta llamk'achiq. Ura rastro: AP frecuencia máxima. (H) Cuantificación de insumos espontáneos postsinápticos (sPSPs) nisqamanta. Chay representativo grabacionpa rastron chaymanta chay zoom ratio nisqapas (I) nisqapim qawarisqa kachkan. Análisis de varianza huk ñanmanta analizasqa n = 5manta 20kama células kimsa chupakunamanta. Willakuykunaqa promedio±SEM nisqawanmi qawarichikun; *P<0,05 nisqa; **P<0,01 nisqa; ***P<0,001 nisqa. (J) Rastros representativos de AP espontáneo grabasqa chay modo de abrazadera de parche perforada nisqawan. Pata rastro: AP frecuencia máxima. Ura rastro: huk APpa hatunyachiynin. (K) (J) nisqaman hina AP frecuencia promedio y máxima nisqa yupay. Mann-Whitney prueba; n = 5 células nisqakunatam tawa chupakunamanta qawarirqaku. Willakuykunaqa promedio±SEM nisqawanmi qawarichikun; mana importantechu.
Sut’i OXPHOS daño tarikurqa kay 8 semanasniyuq Mfn2cKO PN kaqpi, kayqa rikuchin kay función fisiológica kay neuronas kaqmanta sinchi mana normal kaqta. Chayrayku, analizarqayku características eléctricas pasivas kaqta kay neuronas OXPHOS-deficientes kaqmanta 4manta 5 semanasmanta chanta 7manta 8 semanaskama ruwaspa grabaciones de abrazadera parche entera célula kaqmanta kay rebanadas agudas cerebelosas kaqpi ( Figura 2E ). Mana suyasqa hina, kay promedio de membrana samay atiy chanta kay resistencia de entrada kaqmanta kay Mfn2cKO neuronas kaqmanta kay control kaqman rikch’akuq karqa, aunque karqa sutil diferencias kay células ukhupi (Tabla 1). Chaynallataqmi, 4manta 5 semanakama, mana ima hatun tikrakuykuna tarikurqachu chay relación corriente-tensión (curva IV) nisqapi (Figura 2F). Ichaqa, mana huk neuronas Mfn2cKO 7 kaqmanta 8 semanaskama kawsarqankuchu kay IV régimen kaqmanta (paso de hiperpolarización), kayqa rikuchin huk sut’i sensibilidad kaqta kay hiperpolarización potencial kaqman kay qhipa etapapi. Kay contraste kaqpi, kay neuronas Mfn2cKO kaqpi, kay corrientes despolarizantes kaqkuna mayqinkunachus descargas potenciales de acción repetitiva (AP) kaqta ruwanku allinta tolerasqa kanku, kaytaq rikuchin kay patrones de descarga tukuyninku mana anchatachu hukniraq kanku kay neuronas control 8 semanas kaqmanta (Tabla 1 chanta Figura 2G). Chaynallataqmi, frecuencia chaymanta amplitud de corrientes postsinápticas espontáneas (sPSCs) kaqkunaqa tupachisqa karqa kay grupo control kaqwan, chaymanta kay frecuencia de eventos yapakurqa 4 semanasmanta 5 semanaskama 7 semanasmanta 8 semanaskama huk rikch’aq yapakuywan (Figura 2, H y I). PNs kaqpi sináptica puquy pacha ( 25 ). Chaynallataqmi tarikurqa perforados PNs parches nisqamanta. Kay configuración hark’an kay atikuq compensación kay celular ATP defectos kaqmanta, kayhinata ruwakunman kay tukuy célula parche abrazadera grabacionpi. Aswantaqa, mana afectasqachu karqa kay potencial membrana descanso kaqmanta chanta kay frecuencia espontánea disparo kaqmanta kay neuronas Mfn2cKO kaqmanta ( Figura 2, J y K ). Resumenpi, kay ruwakuykuna rikuchinku kay PNs sut’i disfunción OXPHOS kaqwan allinta atipayta atinku kay patrones de descarga de alta frecuencia kaqwan, kayqa rikuchin huk mecanismo de compensación kaqta mayqinchus paykunaman permite mantener respuestas electrofisiológicas yaqa normales kaqta.
Willakuykunaqa promedio ± SEM hinam qawarichikun (anlisis de varianza huk ñanlla, prueba de comparación múltiple de Holm-Sidak; *P<0.05). Unidad yupayqa paréntesis nisqawanmi rikuchikun.
Ñuqaykuqa churarqayku investiganaykupaq sichus mayqin categoríapas proteómica nisqa willakuy huñupi (1G siqi) ñankunata churan, chaykunam sinchi OXPHOS pisiyayta atipanman, chaywanmi sut’incharqayku imaraykum afectasqa PN electrofisiología yaqa normalta waqaychayta atin (2 siqi, Emanta Kkama). . Análisis proteómico nisqa rikuchirqa chay enzimas nisqakuna catabolismo nisqapi aminoácidos de cadena ramificada (BCAA) nisqapi kaqkuna anchata wichayman regulasqa kasqankuta (Figura 3A y Figura S5A), chaymanta chay producto final acetil-CoA (CoA) utaq succinil CoA nisqa tricarboxilatos nisqakunata yapayta atinman Ácido arteriosclerosis (TCA) ciclo nisqapi. Taparqayku kay contenido kay BCAA transaminasa 1 (BCAT1) kaqmanta chanta kay BCAT2 kaqmanta iskayninku yapakusqankuta. Paykunaqa catalizarqanku kay ñawpaq llamk’ayta kay BCAA catabolismo kaqmanta kay glutamato kaqta ruwaspa kay α-cetoglutarato kaqmanta ( 26 ). Llapan subunidades nisqakunam chay complejo cetoácido deshidrogenasa de cadena ramificada (BCKD) nisqamanta ruwanku, chaymi upregulasqa kanku (chay complejo catalizan chay descarboxilación qatiqnin hinaspa mana kutichiy atina chay esqueleto de carbono BCAA nisqamanta) (Figura 3A y Figura S5A). Ichaqa, mana sut’i tikrakuykuna kikin BCAA kaqpi tarikurqachu kay PN t’aqasqa kaqpi, kayqa kanman kay yapasqa celular hap’iy kay aminoácidos esenciales kaqmanta utaq huk fuentes (glucosa utaq ácido láctico) llamk’achisqankurayku kay TCA ciclota yapanankupaq (S5B siqi). PNs mana OXPHOS kaqwan kaqkunapas rikuchirqanku kay glutamina descomposición yapasqa kaqta chanta kay transaminación ruwaykunata kay 8 semanas edad kaqpi, kaytaq rikuchikunman kay up-regulación kaqwan kay enzimas mitocondriales glutaminasa (GLS) chanta kay glutamina piruvato transaminasa 2 (GPT2) kaqmanta (Figura 3, A chanta C). Kayqa allinmi kay GLS kaqpa up-regulación kaqqa kay isoforma spliced ​​glutaminasa C (GLS-GAC) kaqpi limitasqa kachkan (kay Mfn2cKO/CTRL kaqpa tikrakuyninqa yaqa 4,5 kuti, P = 0,05), chanta kay específica up-regulaciónnin kay cáncer tejidos kaqpi Atin yanapayta kay bioenergía mitocondrial kaqpi. (27).
(A) Chay mapa de calor nisqapiqa rikukunmi chay pliegue cambio nisqa nivel proteico nisqapi chay especificado ruta nisqapaq 8 semanas nisqapi. (B) Ejemplo huk rebanada cerebelosa nisqamanta, anticuerpo anti-PCx nisqawan etiquetasqa (barra de escala, 20 μm). Q’illu flechaqa Purkinje celulap kurkunta rikuchin. (C) Análisis de expresión proteica de curso de tiempo riqsichisqa huk importante candidato hina kay aterosclerosis kaqpaq (prueba t múltiple, *FDR <5%; n = 3-5 chupakuna). (D) Hawa: Shuk diagrama esquemático rikuchik chikan chikan ñankunata yaykuyta kay carbono etiquetadoman kay [1-13C]piruvato trazadorpi tiyak (kayqa, PDH utaq trans-arterial ñanta). Ura: Violin tablapiqa rikukunmi pachakmanta huknin carbono huklla etiquetado (M1) nisqa ácido aspartico, ácido cítrico hinaspa ácido málico nisqaman tikrakusqanmanta, chaymantam rebanadas agudas cerebelosas nisqakunata [1-13C]piruvato nisqawan etiquetaspa (prueba t pareada; ** P <0.01). (E) Rikuchisqa ñanmanta tukuy ima pachamanta willaykunata t’aqwiy. 8 semanas kaqpi P<0.05 kaqwan proteínas kaqllata qhawarina . Chiru chiru: mana allinchay chaninchasqa (iskay ñan anlisis de varianza; * P <0,05; *** P <0,001). Datos nisqakunam promedio±SEM nisqapi qawarisqa kachkan.
Análisisniykupiqa, BCAA catabolismoqa hukninmi huk clave up-regulación ñankunaman tukusqa. Kay chiqapqa sinchitam qawarichin chay volúmen de ventilación nisqa ciclo TCA nisqaman yaykuqqa PN nisqapi OXPHOS nisqa mana kaptinqa tikrakunmanmi. Kayqa huk hatun forma kay cableado metabólico neuronal kaqmanta representanman, kaytaq huk chiqan impactoyuq kanman kay fisiología neuronal kaqpi chanta kay kawsakuypi kay mantenimiento kaqpi kay sinchi disfunción OXPHOS kaqpi. Kay hipótesiswan tupaq, tarirqayku kay principal enzima anti-aterosclerótica PCx up-regulada kaqta (Mfn2cKO/CTRL tikrakun yaqa 1,5 kutita; Figura 3A), kaytaq cataliza kay conversión kay piruvato kaqmanta kay oxaloacetato kaqman ( 28 ), kaytaq creekun kay tejido cerebral kaqpi Kay expresión in is restricted to astrocytes (29, 30). Consistente kay proteómica ruwasqakunawan, microscopía confocal rikuchirqa kay expresión PCx específicamente chanta significativamente yapakurqa kay OXPHOS-deficientes PNs kaqpi, chaymanta kay reactividad PCx aswanta restringida karqa kay células gliales Bergmann adyacentes kaqpi kay control kaqmanta ( Figura 3B ). Funcionalmente pruebapaq kay qhawasqa upregulación kay PCx kaqmanta, hampirqayku kay agudo cerebelosa rebanadas kaqwan kay [1-13C]piruvato trazador kaqwan. Piruvato piruvato deshidrogenasa (PDH) nisqawan oxidasqa kaptinqa, isótopo nisqa etiquetanmi chinkarqa , Ichaqa TCA ciclo intermedios nisqamanmi churakun piruvato vascular reacciones nisqawan metabolizado kaptin (3D siqi). Proteómica nisqamanta willakuyniyku yanapaspaqa, kay trazadormanta achka marcadores nisqakunatam qawarirqayku Mfn2cKO rebanadas nisqapa ácido aspartico nisqapi, chaynallataqmi ácido cítrico nisqapas, ácido málico nisqapas huk tendencia moderada nisqayuq karqaku, mana ancha riqsisqa kaptinpas (3D siqi).
Kay dopamina neuronas kaqpi kay MitoPark chupakunamanta kay disfunción mitocondrial kaqwan ruwasqa kay neuronas dopamina kaqwan kay específicamente kay factor de transcripción mitocondrial A gen (Tfam) kaqta chinkachiq (S6B siqi), kay PCx expresión kaqtapas anchata up-regulada karqa (31), kaytaq rikuchin kay arteriosclerosis ácido acetona kaqmanta Kay unquypa rikhuriyninqa regulasqa kachkan kay disfunción neuronal kaqpi OXPHOS nisqa cuerpopi. Kayqa allinmi kayta qhawarinapaq, tarikurqa kay enzimas únicas (32-34) kaqkuna kay neuronas kaqpi expresasqa kankuman mayqinkunachus kay arteriosclerosis kaqwan hukllachasqa kankuman kay PNs kaqpi mana OXPHOS kaqpi, kayhinata kay propionil-CoA carboxilasa (PCC-A) kaqpi, kay Malonil-CoA tikran kay propionil-CoA kaqta kay succinil-CoA kaqman chanta kay enzima mitocondrial malica 3 kaqman (ME3), . mayqinpa hatun ruwayninqa piruvato malatomanta kutichiymi (3, A y C siqi) (33, 35). Hinallataq, tarirqayku huk hatun yapakuyninta kay enzima Pdk3 kaqpi, kaytaq fosforila chaymanta kayhinata inactiva kay PDH kaqpi ( 36 ), chaymanta mana huk cambiokuna tarikurqachu kay enzima Pdp1 kaqpi mayqinchus activan kay PDH kaqpi utaq kay kikin complejo enzima PDH kaqpi ( Figura 3A ). Constantemente, kay Mern2cKO PNs kaqpi, kay fosforilación kay α1 subunidad α (PDHE1α) subunidad kaqmanta kay piruvato deshidrogenasa E1 componente kaqmanta kay PDH complejo kaqmanta kay Ser293 kaqpi (yachasqa kay PDH actividad enzima hark’ananpaq) kallpachasqa karqa ( Figura S6C) ( Figura S6C). Piruvato mana vasculares nisqaman yaykuyniyuqchu.
Tukuyninpiqa, tarirqayku kay super ñan kay serina chanta kay glicina biosíntesis kaqmanta, kay relacionado folato mitocondrial (1C) ciclo kaqmanta chanta kay prolina biosíntesis kaqmanta (Figura 1G chanta Figura S5C) tukuyninku significativamente up-regulados kasqankuta, willaykunamanjina, kay activación ruwaypi. Muyuriq tejidos kaqkunaqa activakunku kay disfunción mitocondrial kaqwan (5-7). Análisis confocal kay proteómica willayta yanapaq rikuchirqa kay PN kaqpi kay OXPHOS faltasqa kaqwan, kay 8 semanasniyuq chupakunamanta cerebelosa rebanadas kaqta kay serina hidroximetiltransferasa 2 (SHMT2) kaqman sujetasqa karqanku, huk enzima clave kay ciclo mitocondrial folato kaqmanta. Inmune kutichiy ancha riqsisqa (S5D siqi). 13 CU-glucosa-incubasqa rebanadas agudas cerebelosas kaqpi, experimentokuna metabólico rastreo kaqpi aswanta chiqancharqanku kay up-regulación kay serina chanta prolina biosíntesis kaqmanta, kaytaq rikuchirqa kay flujo kay isoformas de carbono kaqmanta kay serina kaqman chanta kay prolina kaqman yapakusqanmanta ( Figura S5E ). Kay reacciones promocionadas kay GLS kaqwan kay GPT2 kaqwan responsables kanku kay síntesis kay glutamato kaqmanta kay glutamina kaqmanta chanta kay transaminación kay glutamato chanta kay α-cetoglutarato kaqwan, kay upregulaciónninkuqa rikuchin kay neuronas OXPHOS-deficientes kaqta huk yapasqa mañakuyniyuq kay glutamato kaqmanta , Kayqa kanman kay dirigido kay mantener kay yapasqa biosíntesis kay prolina kaqmanta (Figura S5C). Kay tikrakuykunamantaqa, huk análisis proteómico astrocitos cerebelares kaqmanta kay PN-específicos Mfn2cKO chupakunamanta rikuchirqa kay ñankuna (llapa antiperoxidasas kaqwan) mana anchatachu tikrakusqankuta expresión kaqpi, kayhinata rikuchirqa Kay redirección metabólica selectiva kaqta kay PN degradado kaqman (Fig. S6, Dmanta Gkama).
Resumenpi, kay análisis kaqkunaqa rikuchirqanku significativamente hukniraq patrones kaqta kay activación temporal kaqmanta kay vías metabólicas específicas kaqmanta kay PNs kaqpi. Aunque kay función mitocondrial neuronal mana normal kaqqa kay aterosclerosis temprana kaqman chanta kay remodelación 1C kaqman ima apayta atin ( Figura 3E chanta Figura S5C kaqpi), chanta kay cambios predecibles kaqtapas kay expresión kay complejos I chanta IV kaqpi, kay cambios kay síntesis de serina de novo kaqpi kaqlla Kay qhipa etapasllapi rikukurqa. OXPHOS mana allin llamkay (3E siqi hinaspa S5C siqi). Kay tarikuykuna huk secuencial ruwayta riqsichin maypichus kay estrés-inducido mitocondrial (1C ciclo) chanta citoplasmático (serina biosíntesis) kutichiy sinérgicamente kay aterosclerosis yapakuyninwan kay TCA ciclo kaqpi kay metabolismo neuronal kaqmanta ruwananpaq.
8 semanasniyuq kay OXPHOS-deficientes PNs kaqkunaqa kay actividad excitación de alta frecuencia kaqpi waqaychayta atinku chanta kay reconexión metabólica significativa kaqwan ruwakunku kay disfunción mitocondrial kaqta compensanankupaq. Kay tariyqa huk munay atiyta hatarichin kay ratopipas, kay células kaqkunapas Chaskinkumanmi intervención terapéutica kaqta kay neurodegeneración kaqta tardanankupaq utaq hark’anankupaq. Unayay. Kay atiytaqa iskay sapanchasqa intervencionkunawanmi allicharqayku. Ñawpaq kaq ruwaypi, huk Cre-dependiente adeno-asociado virus (AAV) vectorta ruwarqayku chaymanta MFN2 akllaspa expresakunman kay OXPHOS-deficientes PNs kaqpi in vivo kaqpi ( Figura S7A ). Kay AAV codificador kay MFN2 chanta kay gen reportero fluorescente mCherry (Mfn2-AAV) kaqmanta chiqaqchasqa karqanku kay cultivos primarios neuronas kaqpi in vitro kaqpi, kaytaq ruwarqa kay MFN2 expresasqa kaqta huk Cre-dependiente kaqpi chanta kay morfología mitocondrial kaqta qispichirqa, kaywantaq hark’arqa kay neuromutación kay Mfn2cKO neuronas kaqpi ( Figura S7, B, D chanta E). Chaymanta, ruwarqayku in vivo experimentokunata estereotácticamente chayachinaykupaq 8 semanayuq Mfn2-AAV nisqa corteza cerebelosa nisqaman Mfn2cKO nisqamanta chaymanta control chupakunamanta, chaymanta analizarqayku 12 semanayuq chupakunamanta ( Figura 4A ). Chay hampisqa Mfn2cKO chupakunaqa wañurqakum (1, A hinaspa B siqi) (16). Transducción viral in vivo kaqpi huk expresión selectiva kay PN kaqmanta wakin cerebelosa círculos kaqpi ruwakurqa ( Figura S7, G chanta H ). Kay inyección kay control AAV kaqmanta expresaq mCherry (Ctrl-AAV) kaqllata mana huk significativo efectotachu ruwarqa kay grado de neurodegeneración kaqpi kay Mfn2cKO uywakunapi. Kay contraste kaqpi, kay análisis kay Mfn2cKOs transducidos kay Mfn2-AAV kaqwan rikuchirqa huk significativo protector efectota kay capa celular PN kaqmanta ( Figura 4, B y C ). Aswantaqa, kay densidad neuronas kaqqa yaqa mana distinguiblechu rikch’akun kay control uywakunamanta ( Figura 4, B y C, chanta Figura S7, H y I). Kay expresión kay MFN1 kaqmanta ichaqa mana kay MFN2 kaqmantaqa kaqlla allinchu kay neuronal wañuyta qispichiypi ( Figura 4C chanta Figura S7, C chanta F), kaytaq rikuchin kay expresión kay MFN1 ectópico kaqmanta allinta yapayta atinman kay falta kay MFN2 kaqmanta. Aswan análisis kay sapalla PN nivelpi rikuchirqa kay Mfn2-AAV hatunmanta qispichirqa kay ultraestructura kay mitocondrias kaqmanta, normalizarqa kay niveles de ADNmt kaqmanta, chanta kay alto expresión kay marcador anti-angiogénesis kaqmanta kay PCx kaqmanta kutichirqa (Figura 4, C a E). Rikuy qhaway kay qispichisqa Mfn2cKO chupakunamanta huk samay estadopi rikuchirqa kay posturanku chanta kay motor síntomasninku (kuyuy S1 kaqmanta S3 kaqkama) allinchasqa kasqankuta. Tukuchinapaq, kay experimentokuna rikuchinku kay tarda reintroducción kay MFN2 kaqmanta kay PNs kaqman sinchita pisiyuq kay OXPHOS kaqpi suficiente kaqta kay mtDNA mikhuyta kutichiypaq chanta kay aterosclerosis kaqta inducinanpaq, chaywantaq hark’an kay degeneración axónica kaqmanta chanta kay wañuy neuronal kaqmanta in vivo kaqpi.
(A) Huk esquema rikuchiq kay horario experimental kaqta inyectanapaq kay AAV codificador kay MFN2 kaqmanta mayk’aqchus kay rikuchisqa metabólico ñan activasqa kachkan. (B) Representantes fotografías confocales kaqmanta 12 semanasniyuq secciones cerebelosas kaqmanta transducidas kay Mfn2cKO chupakunawan kay 8 semanas kaqpi chanta etiquetados kay anticuerpo anti-Calbindin kaqwan. Paña: Fibras axónicas nisqakunaq escama nisqa. Chay axónico zoom nisqapa escalanqa 450 hinaspa 75 μm. (C) Lloq’e: Cuantificación kay densidad celular Purkinje kaqmanta kay AAV transducción bucle kaqpi (AAV+) (análisis de varianza huk ñanmanta; n = 3 chupakuna). Paña: análisis de enfoque mtDNA kaqpi kay PN transducido kaqpi kay 12 semanapi (prueba t mana parisqa; n = 6 células kimsa chupakunamanta). * P <0,05 nisqa; ** P <0,01 nisqa. (D) Micrografías electrónicas de transmisión representativas kaqmanta PNs kaqmanta kay Mfn2cKO secciones cerebelosas kaqmanta transducidas kay vectores virales rikuchisqa kaqwan. Rosa mascaraqa dendritas nisqakunaq tiyasqan cheqastan rikuchin, q’ello ch’eqeyoq cuadradotaq paña ladopi zoom nisqa qosqa kaqta rikuchin; n nisqaqa núcleo nisqatam riqsichin. Escala barra, 1μm. (E) rikuchin huk ejemplota tinción PCx kaqmanta kay PN transducido kaqpi 12 semanas kaqpi. Escala barra, 20μm. OE, llumpay rimay; FC, pliegue cambiay.
Tukuyninpiqa, investigarqayku kay peroxidasa-inducida celular kawsakuypa ancha chaniyuq kayninta kay PNs kaqpi mayqinkunachus OXPHOS disfunción kaqwan tarikurqanku. Kay mCherry codificador AAV-shRNA (ARN corto horquilla) específicamente dirigisqa kay PCx mRNA (AAV-shPCx) kaqmanta ruwarqayku, chanta kay virusta utaq kay control revuelto (AAV-scr) kaqta kay cerebelo kaqman kay Mfn2cKO chupakunamanta inyectarqayku. Kay inyección ruwakurqa tawa kaq semana edadpi ( Figura 5A ) allin PCx knockdown nisqaman chayanapaq chay pachakunapi maypichus PCx expresión yapakurqa ( Figura 3C ) chaymanta capa celular PN mana imayuqraq karqa ( Figura 1A ). Kayqa allinmi kay PCx urmachiyqa (S8A siqi) huk ancha utqaylla PN wañuyman apamun, chaymi sapallan anillo restringido infección kaqmanta (5, B hinaspa C siqi). Kay mecanismota entiendenapaq kay efectos metabólicos inducidos kay PCx up-regulación kaqwan, estudiarqayku kay redox estadota kay PNs kaqmanta kay PCx knockdown kaqmanta chanta kay AAV-mediado biosensor óptico Grx1-roGFP2 kaqmanta huk kutillapi expresasqa karqanku (Figura S8, B a D) kay glutatión chaninchanapaq Kay relativo cambio kay péptido redox potencial kaqmanta (38). Chaymanta, ruwarqayku iskay foton fluorescencia kawsay pacha imajinas microscopía (FLIM) agudo cerebro rebanadas 7 semanas Mfn2cKO utaq control littermates tarinapaq potencial cambios kay estado redox citoplasmático kaqpi verificar condiciones FLIM kaqmanta ( Figura S8, E a G). Kay análisis rikuchirqa huk hatun yapakuyninta kay estado de oxidación kaqpi huk sapalla Mfn2cKO PNs kaqpi mana PCx expresión kaqwan, kaytaq hukniraq kay neuronas control kaqmanta utaq kay Mfn2cKO PNs kaqmanta expresaq kay shRNA revuelta kaqllamanta ( Figura 5, D y E ). PCx expresión urayman regulasqa kaqtin, pachakmanta huknin Mfn2cKO PNs rikuchiq huk estado altamente oxidado kaqmanta yapakurqa aswan kimsa kuti ( Figura 5E ), kayqa rikuchin kay PCx up-regulación kay redox capacidadta kay neuronas degeneradas kaqmanta waqaycharqa.
(A) Huk esquema rikuchiq kay horario experimental kaqta kay AAV codificador shPCx inyectanapaq mayk’aqchus kay rikuchisqa metabólico ñan activasqa kachkan. (B) Representantes fotografías confocales kaqmanta 8 semanasniyuq secciones cerebelosas kaqmanta kay Mfn2cKO chupakunapi transducidos chanta etiquetados kay anticuerpo anti-calcineurina kaqwan kay 4 semanas kaqpi. Barra de escala, 450μm. (C) Cuantificación kay densidad celular Purkinje kaqmanta kay AAV-transducidos bucles kaqpi (huk ñan análisis de varianza; n = 3 kaqmanta 4 chupakuna). Willakuykunaqa promedio±SEM nisqawanmi qawarichikun; ***P<0,001 nisqa. (D) Representante FLIM siq’i rikuchin kay promedio kawsayta kay 7 semanasniyuq PN expresaq glutatión redox sensor Grx1-roGFP2 kay especificadas condiciones experimentales kaqpi. LUT (tabla qhaway) ratio: kawsakuy pacha chawpi (picosegundos nisqapi). Escala barra, 25μm. (E) Kay histograma rikuchin kay distribución kay Grx1-roGFP2 kawsay pacha valores kaqmanta (D) (n=158 kaqmanta 368 células kaqkama iskay chupakunapi sapa condicionpi). Sapa histograma nisqapa hawanpi kaq tabla de círculo nisqa: qawarichinmi hayka células nisqakunam aswan unay (puka, oxidado) utaq aswan pisi (azul, pisiyachisqa) kawsay chaninchasqayuq, chaykunam 1 SD nisqamanta aswan hatun kanku chay promedio de vida valor nisqamanta CTRL-AAV-scr nisqapi. (F) Kay modelo propuesto rikuchin kay efecto protector kay upregulación kaqmanta kay PCx neuronal kaqmanta.
Tukuy imapi, kaypi qusqayku willaykunaqa rikuchinku kay MFN2 kaqmanta expresionqa tukuyninpi qispichiyta atin kay ñawpaqman purisqa PN kaqwan sinchi OXPHOS pisiyaywan, sinchi mtDNA pisiyaywan, chanta ancha mana normal ista-hina morfología kaqwan, chaywantaq sapa kuti ñawpaqman puriyta qun ñawpaq unquykunapipas. Neurodegeneración kaqqa reversible pruebakunata qun kay etapamanta manaraq célula wañuchkaptin. Kay grado de flexibilidad metabólica aswanta kallpachasqa kay neuronas atiyninkuwan kay aterosclerosis (huk cableado kay ciclo TCA kaqmanta), kaytaq hark’an kay PCx expresión kaqta kay PNs mana OXPHOS kaqwan chanta kallpachan kay wañuy celulares kaqpi, chaywantaq huk hark’aq ruwayta ruwan ( Figura 5F ).
Kay yachaypi, pruebakunata qurqayku kay PNs kutichiynin kay OXPHOS disfunción kaqman pisimanta pisi convergen kay TCA ciclo aterosclerosis kaqman kay diferencial activación ñanwan activasqa kay programas metabólicos kaqwan. Kay análisis proteómico kaqtaqa achka métodos complementarios kaqwan chiqancharqayku chanta rikuchirqayku kay sinchi disfunción mitocondrial kaqwan impugnasqa kaqtinku, neuronas huk ñawpaq mana riqsisqa forma elasticidad metabólica kaqwan kasqankuta. Musphayniykupaq, tukuy proceso de cableado mana necesariamentechu marcan kay estado metabólico terminal kaqta kay neurodegeneración kaqwan pisi pisimanta chanta mana kutichiy atina kaqwan, ichaqa kay datosniykuqa rikuchin kay huk neurona de mantenimiento kaqta ruwayta atinman kay etapapi manaraq wañuy celular kaqpipas Mecanismo de compensación funcional. Kay tariyqa rikuchin kay neuronas huk hatun grado de plasticidad metabólica kaqta kay cuerpopi. Kay chiqaqa pruebakun kay qhipaman MFN2 kaqmanta riqsichiyqa kay expresión kay marcadores metabólicos clave kaqmanta kutichiyta atin chanta kay PN degeneración kaqta hark’anman. Aswanpas aterosclerosis onqoyta hark’an, nerviokunatapas usqhayllan purichin. transsexual.
Huknin aswan munay tarikuykuna kay investigacionniykupi kay PNs mana OXPHOS kaqwan kay metabolismo ciclo TCA kaqta tikrayta atinku kay enzimas up-regulación kaqwan mayqinkunachus específicamente kay arteriosclerosis kaqta kallpachanku. Kay reordenamiento metabólico huk común característica kay células cánceres kaqmanta, wakinninku kay glutamina kaqpi hapipakunku kay TCA ciclo intermedios kaqta yapanankupaq kay reductor equivalentes ruwanankupaq, kaytaq kay cadena respiratoriata purichinku chanta kay lípidos chanta kay nucleótidos biosíntesis precursores ruwayta waqaychanku (39 , 40). Huk kunanllaraq ruwasqa yachay rikuchirqa kay tejidos periféricos kaqpi kay OXPHOS disfunción kaqwan, kay reconexión kay metabolismo glutamina/glutamato kaqmanta huk riqsisqa ruwayllataq ( 5 , 41 ), maypichus kay dirección kay glutamina yaykuymanta kay ciclo TCA kaqman dependen kay OXPHOS k’irisqa sinchi kayninrayku ( 41 ). ). Ichaqa, mana kanchu sut’i pruebakuna ima rikch’akuypas kay plasticidad metabólica neuronal kaqmanta kay cuerpopi chanta kay relevancia atikuqninmanta kay unquy contextopi. Kay qhipa in vitro yachaypi, neuronas corticales primarias rikuchikurqa kay piscinas de glutamato kaqta movilizanankupaq kay neurotransmisión kaqpaq, chaywantaq kay metabolismo oxidativo chanta kay aterosclerosis kaqta kallpacharqanku kay condiciones de estrés metabólico kaqpi ( 42 ). Kayqa allinmi kay inhibición farmacológica kaqpi kay TCA ciclo enzima succinato deshidrogenasa kaqmanta, kay carboxilación piruvato kaqmanta iñikun kay síntesis kay oxaloacetato kaqmanta kay neuronas gránulo cerebelosa cultivadas kaqpi ( 34 ). Ichaqa, kay relevancia fisiológica kay mecanismos kaqmanta kay tejido cerebral kaqman (maypichus kay aterosclerosis kaqqa aswanta astrocitos kaqpi confinasqa kaqta iñikun) kunankamapas huk importante significación fisiológica kaqwan kachkan ( 43 ). Kay casopi, datosniykuqa rikuchinku kay PNs dañados kay OXPHOS kaqwan kay cuerpopi kankuman tikrakunman kay degradación BCAA kaqman chanta kay carboxilación piruvato kaqman, kay iskay principales fuentes kay suplementación kaqmanta kay intermedios de piscina TCA kaqmanta. Aunque kay putativo contribución kay catabolismo BCAA kaqmanta kay metabolismo energético neuronal kaqman propuesta karqa, kay glutamato chanta kay GABA ruwayninmanta aswanta kay neurotransmisión kaqpaq ( 44 ), kunankama mana kanchu prueba kay mecanismos kaqpaq kay in vivo kaqpi. Chayrayku, mana sasachu yuyaymanay kay PNs disfuncionales kaqkuna kikinmanta compensar kay consumo kay intermedios TCA kaqmanta kay proceso de asimilación kaqwan purichisqa kay aterosclerosis yapasqawan. Aswanta, upregulación kay PCx kaqmanta necesitakunman huk yapasqa mañakuy kay ácido aspartico kaqmanta waqaychaypaq, kaytaq rikuchikurqa kay células proliferantes kaqpi kay disfunción mitocondrial kaqwan ( 45 ). Ichaqa, análisis metabolómico nisqaykuqa manan rikuchirqanchu ima significativo cambiokunatapas kay nivel de estado estacionario nisqapi ácido aspartico nisqapi Mfn2cKO PNs nisqapi (Figura S6A), chaymi presumiblemente rikuchin hukniray metabólico utilización nisqa ácido aspartico nisqamanta células proliferantes nisqawan neuronas post-mitóticas nisqawan . Aunque kay mecanismo exacto kay PCx upregulación kaqmanta kay neuronas disfuncionales kaqpi in vivo kaqpi caracterizasqa kachkan, rikuchirqayku kay precoz kutichiy huk importante ruwayta ruwan kay estado redox kay neuronas kaqmanta waqaychaypi, kaytaq rikuchikurqa kay experimentos FLIM kaqpi kay rebanadas cerebelosa kaqpi. Aswanta, hark’ay kay PNs kaqmanta kay PCx up-regulación kaqmanta huk aswan oxidado estadoman apayta atin chanta kay células wañuyta usqhayllata ruwanman. Kay activación kay BCAA degradación kaqmanta chanta kay carboxilación kay piruvato kaqmanta mana imaynachu kanku kay tejidos periféricos kaqmanta kay disfunción mitocondrial kaqmanta caracterizanankupaq (7). Chayrayku, paykunaqa huk ñawpaq ruway hina kanku kay OXPHOS-deficientes neuronas kaqmanta, mana sapalla ruway kaqtinpas, kaytaq ancha chaniyuq neurodegeneración kaqpaq. .
Cerebelosa unquyqa huk heterogéneo laya neurodegenerativa unquymi mayqinchus aswanta ataxia hina rikukun chanta sapa kuti PNs kaqta waqllichin ( 46 ). Kay neuronas población kaqqa aswanta vulnerables kay disfunción mitocondrial kaqman imaraykuchus kay degeneración selectiva kay chupakunapi suficiente kan kay achkha sintomas motores kaqmanta mirachinapaq mayqinkunachus kay ataxia espinocerebelosa runamanta caracterizanku ( 16 , 47 , 48 ). Willakuykunamanhina, huk modelo transgénico de rata huk gen mutante kaqwan huk ataxia espinocerebelosa runawan hukllachasqa kachkan chanta kay disfunción mitocondrial kaqwan ( 49 , 50 ), kaytaq enfatiza kay importante kaqta kay consecuencias kaqmanta kay OXPHOS pisiyaymanta kay PNPH kaqpi yachaymanta. Chayrayku, aswan allin kanman allinta t’aqanapaq chanta kay sapalla neuronas población kaqmanta yachaypaq. Ichaqa, kay PNs ancha sensibles kasqankurayku kay presión kaqman chanta huk pisi proporción tukuy población celular cerebelosa kaqmanta cuentata qunku, kay achkha estudios basados ​​en ómicos kaqpaq, kay separación selectiva kay tukuy células hina huk aspecto sasachakuyraq kachkan. Yaqa mana atikunmanchu huk laya células kaqmanta (aswanta kuraq tejidos kaqmanta) contaminación absoluta falta ruwayta chaypas, huk efectivo disociación paso FACS kaqwan hukllawarqayku huk suficiente yupay neuronas viables análisis proteómica aguas abajo kaqpaq tarinaykupaq, chanta Bastante alto cobertura proteicayuq kayku (yaqa 3000 proteínas) kay kunan kaq conjunto de datos kaqwan tupachisqa tukuy cerebelo kaqmanta ( 51 ). Waqaychaspa kay viabilidad tukuy células kaqmanta, kay método qusqayku mana mitocondrias kaqpi metabólicos ñankunapi tikrakuykunallatachu qhawayta atichiwanchik, aswanpis kay citoplasmáticos kaqninpi tikrakuykunata qhawayta, kaytaq complementa kay enriquecimiento etiqueta membrana mitocondrial específica kaqmanta kay tipos celulares kaqmanta llamk’ayta Kay musuq método kay yupay mitocondrias kaqmanta kay complejos tejidos kaqpi (52, 53). Kay método willasqaykuqa mana kay células Purkinje kaqmanta yachayllawanchu tinkin, aswanpis mayqin laya célula kaqmanpas facil-llata churakunman kay cambios metabólicos kaqta unqusqa umapi allichanapaq, huk modelos kay disfunción mitocondrial kaqmanta ima.
Tukuyninpaq, huk ventana terapéutica kaqta riqsichirqayku kay metabólico rearreglo ruwaypi mayqinchus tukuyninpi kutichiyta atinman kay señales clave kaqmanta kay estrés celular kaqmanta chanta hark’anman kay degeneración neuronal kaqmanta. Chayrayku, kaypi willasqa cableado kaqmanta implicaciones funcionales kaqta hamut’ayqa, fundamental qhawaykunata qunman kay atikuq hampikunamanta kay viabilidad neuronal kaqta waqaychaypaq kay disfunción mitocondrial kaqpi. Hamuq investigacionkuna diseccionta ruwanapaq kay cambios kay metabolismo energético kaqpi huk tipos de células cerebrales kaqpi necesitakun tukuyninpi rikuchinapaq kay principio aplicable kaqta wak neurológicas unquykunaman.
MitoPark chupakunamantaqa ñawpaqtaraqmi willakunku ( 31 ). C57BL/6N chupakuna loxP flanqueo Mfn2 genes kaqwan ñawpaqta willasqa kanku ( 18 ) chanta chimpachisqa kanku L7-Cre chupakunawan ( 23 ). Chaymantaqa chay iskay heterocigóticos progenie ruwasqakunam homocigóticos Mfn2loxP/Mfn2loxP chupakunawan chimpachisqa karqa, chaynapi Purkinje-específicos gen knockouts nisqakunata Mfn2paq (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre) paqarichinankupaq. Huk subconjunto de apareamiento kaqpi, kay Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP alelo (stop-mtYFP) riqsichikurqa huk cruzamientos yapasqawan ( 20 ). Llapan uywa ruwaykuna ruwasqa karqan Europa, suyu hinallataq institucional kamachiykunaman hina hinallataq LandesamtfürNatur Umweltmanta hinallataq Verbraucherschutzmanta, Renania del Norte-Westfalia, Alemaniamanta aprobasqa. Uywa llamk’ayqa Federación Europea de Asociaciones de Ciencias Animales de Laboratorio nisqapa pusaynintapas qatipanmi.
Wiksayuq warmipa cuello uterinomanta lluqsiyninta anestesiaptinkuqa, chupapa embrionnintam sapaqchanku (E13). Chay corteza nisqa diseccionasqa karqan Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) nisqapi 10 mM Hepes nisqawan yapasqa, chaymantataqmi pasasqa karqan Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium nisqapi papaína (20 U/ml) hinallataq cisteína (1μg/ml) nisqawan. DMEM nisqapi chay tejidota incubar) hinaspa digestión enzimática nisqawan disociana. Ml) 37°C nisqapi 20 minutu, chaymantataq mecánicamente molino DMEM nisqapi 10% suero fetal bovino nisqawan yapasqa. Células nisqakunatam tarpurqaku vidrio tapakunapi polilisinawan qatasqapi 2×106 densidadpi sapa 6 cm plato de cultivo nisqapi utaq 0,5×105 células/cm2 densidadpi análisis de imagen nisqapaq. 4 horasmanta, chay mediota tikrakurqa Neurobasal mana sueroyuq mediowan, chaypim karqa 1% B27 suplemento hinaspa 0,5 mM GlutaMax. Chaymantaqa neuronas nisqakunatam 37°C nisqapi hinaspa 5% CO2 nisqapi tukuy experimentopi waqaycharqaku, hinaspam semanapi huk kutita mikuchirqaku. Kay recombinación in vitro kaqpi inducenapaq, 3μl (24-pozo plato) utaq 0,5μl (24-pozo placa) kay AAV9 virus vector kaqmanta llamk’achikurqa kay neuronas hampinapaq kay iskay kaq p’unchawpi in vitro kaqpi: AAV9.CMV.PI.eGFP. WPRE.bGH (Addgene, catálogo yupay 105530-AAV9) chaymanta AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Addgene, catálogo yupay 105545-AAV9).
Ratón Mfn1 chanta Mfn2 ADN complementario (Addgene plásmido #23212 chanta #23213 kaqmanta jap’isqa, sapa juk) kay V5 secuenciawan (GKPIPNPLLGLDST) kay C-terminal kaqpi marcasqa kanku, chanta kay mCherry kaqwan marcopi kay T2A secuencia kaqnintakama fusionasqa kanku. Grx1-roGFP2 nisqaqa Heidelberg T. P. Dick DFKZ (Deutsches Krebsforschungszentrum) nisqap qusqanmi. Kay tdTomato cassetteta tikraspa kay convencional clonación ruwaykunawan, kay casete subclonasqa karqa kay pAAV-CAG-FLEX-tdTomato columna vertebral kaqman (Addgene referencia numero 28306) kay pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, pAAV-CAG- FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 chaymanta pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 nisqa vectores nisqakuna. Chayman rikchakuq estrategia ruwakurqa kay vector control pAAV-CAG-FLEX-mCherry ruwanapaq. Kay AAV-shPCx ruwayta ruwanapaq, huk plásmido AAV vector (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]) necesitakun, mayqinchus kay ADN secuenciata codifican kay shRNA kay PCx rataman (5′CTTTCGCTCTCTAAGGTGCTAAACTCGAGGTTTAGCACCTTAGAGCGAAAG 3′) U6 promotorpa controlninpiqa, mCherryqa CMV promotorpa controlninpim llamk’achisqa. Chay vectores AAV auxiliar nisqakuna ruwayqa ruwakurqa ruwaqpa kamachisqanman hinam (Cell Biolabs). Pisi rimayllapi, huk plásmido transferenciata apaykachana mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) transitoriamente Transfección de células 293AAV-T2A-MFN1-V5), mCherry (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) utaq Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2) codificador gen, hinallataq codificador AAV1 cápsida proteína hinallataq accesorio proteína Packaging plásmido plásmido, método fosfato calcio kaqwan. Chay crudo virus sobrenadanteqa ciclos de congelación-descongelación nisqawanmi hurqusqa karqa ch’aki hielo/etanol baño nisqapi chaymanta células lisas nisqawan salina tamponada fosfato (PBS) nisqapi. Chay vector AAV nisqa chuyanchasqa karqan ultracentrifugación gradiente de iodixanol discontinua nisqawan (24 horas 32.000 rpm y 4°C nisqapi) chaymantataqmi concentrasqa karqan filtro centrífugo Amicon ultra-15 nisqawan. Título genoma kaqmanta AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2,9×1013 copia genoma (GC)/ml], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6,1×1012 GC/ml), AAV1-CAG- FLEX karqa ñawpaq willasqa hina (54), tupusqa chiqap pacha cuantitativo PCR (qPCR) kaqwan -MFN1-V5 (1,9×1013 GC/ml) y AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8,9×1012 GC/ml) nisqa.
Neuronas primarias nisqakunatam rasparqaku hielo hina chiri 1x PBS nisqapi, pellet nisqawan, chaymantam homogeneizarqaku 0,5% Triton X-100 / 0,5% desoxicolato de sodio/PBS tampón de lisis nisqapi, chaypim karqa fosfatasa hinaspa inhibidor de proteasa (Roche). Cuantificación proteica nisqa ruwakurqa ensayo de ácido bicinconínico nisqawan (Thermo Fisher Scientific). Chaymantaqa chay proteínas nisqakunatam rakirqaku electroforesis de gel SDS-poliacrilamida nisqawan, chaymantam blot nisqawan membrana de flúor de polivinilideno (GE Healthcare) nisqaman. Mana específico kaq sitiokunata harkay hinaspa anticuerpo primariowan (qhaway Tabla S1 detallespaq) 5% lechepi TBSTpi (Tris-buffered saline with Tween), mayllana ruwaykunapi hinaspa anticuerpo secundariowan TBST Incubate nisqapi incubar. Anticuerpo primariowan huk tuta +4°C nisqapi incubar. Mayllakuspaqa, anticuerpo secundario nisqatam 2 horata temperatura ambiente nisqapi churana. Chaymanta, kikin blot nisqa anticuerpo anti-β-actina nisqawan incubasqa, kikin carga nisqa chiqanchasqa karqa. Detección quimiluminescenciaman tikraspa chaymanta quimiluminescencia kallpachaspa (GE Healthcare).
Chay neuronas ñawpaqta tarpusqa vidrio tapakunapi 4% paraformaldehído (PFA)/PBS nisqawanmi chay especificado tiempo nisqapi temperatura ambiente nisqapi 10 minutos nisqapi takyachisqa karqa. Chay tapakuna ñawpaqtaqa 0,1% Triton X-100/PBS nisqawanmi 5 minuto temperatura ambiente nisqapi, chaymantataq tampón bloqueante nisqapi [3% albúmina de suero bovino (BSA)/PBS] nisqapi. Iskay kaq p’unchawpiqa, tapakuna tampón bloqueantewan mayllasqa karqanku, chaymantataq anticuerpo secundario conjugado fluoróforo nisqawan tupaqwan 2 horas temperatura ambiente nisqapi incubarqunku; tukukuypiqa, muestrakunatam allinta mayllarqaku PBS nisqapi 4′,6-diamidino-2 -Fenilindol (DAPI) nisqawan contratintasqa chaymantam microscopio diapositiva nisqapi Aqua-Poly/Mount nisqawan takyachisqa.
Ratones (qhari warmi) anestesiarqanku inyección intraperitoneal kaqwan ketamina (130 mg/kg) chanta xilazina (10 mg/kg) kaqwan chanta subcutáneamente carprofeno analgésicos (5 mg/kg) kaqwan churarqanku , Hinallataq churarqanku huk instrumento estereotáctico (Kopf) equipado huk q’uñi almohadillawan. Uma tulluta rikuchiy hinaspa kiru taladrowan corteza cerebelosa nisqapa parten mis tulluman tupaqninta llañuyachinapaq (lambdamanta: chupa 1.8, lateral 1, lóbulo IV hinaspa V nisqaman tupaq). Huk kurkuyuq jeringa agujawan allinta qhawarispa huk huch’uy t’uquta uma tullupi ruway, mana uraypi vasculaturata ch’aqwananpaq. Chaymantaqa chay llañu dibujasqa vidrio capilar nisqatam pisi pisimanta micro-uchkuman churanku (-1,3manta -1kama dura materpa ventral ladonpi), chaymantam 200manta 300 nlkama AAV nisqa micro-inyectorman (Narishige) inyectanku jeringas manuales nisqawan (Narishige) achka kutita pisi presión nisqapi 10manta 20 minutokama ventanapi. Infusión ruwasqamanta qhipaman, capilarta huk 10 minutukunata churana, chay virus tukuyninpi mast’arikunanpaq. Capilarkunata hurquptinkuqa, qarata allinta suturanku, chaynapi heridakuna manaña inflamación kananpaq, uywapas allinyananpaq. Uywakunataqa analgésicos (caspofeno) nisqawan hampichikurqanku askha p’unchaykuna operacionmanta qhepaman, chay tiempopin allinta qhawarirqanku cuerponkupi imayna kashasqankuta, chaymantataqmi eutanasia ruwarqanku chay nisqa tiempopi. Tukuy ruwaykuna ruwakurqa Europa, suyu, institucional kamachiykunamanhina, chaymanta LandesamtfürNatur Umweltmanta chaymanta Verbraucherschutzmanta, Renania del Norte-Westfalia, Alemaniamanta aprobasqa karqa.
Uywakunatam anestesiarqaku ketamina (100 mg/kg) hinaspa xilazina (10 mg/kg) nisqawan, chaymantam sunquta perfusarqaku ñawpaqta 0,1 M PBS nisqawan, chaymantam 4% PFA nisqawan PBS nisqapi. Chay tejidota diseccionaspa 4% PFA/PBS nisqapi huk tuta 4°C nisqapi fijarqanku. Huk kuyuriq cuchillo (Leica Microsystems GmbH, Viena, Austria) nisqawanmi PBS nisqapi takyasqa umamanta secciones sagitales (50 μm rakhu) nisqa wakichisqa karqan. Mana huk nisqa kaptinqa, tinción de secciones libres flotantes nisqa ruwakurqa imaynam ñawpaqpi (13) nisqanman hina temperatura ambiente nisqapi hinaspa kuyurichispa. Pisi rimayllapi, ñawpaqtaqa, chay rebanadas obtenidas nisqakunatam permeabilizarqaku 0,5% Triton X-100/PBS nisqawan 15 minuto temperatura ambiente nisqapi; wakin epítopos kaqpaq (Pcx chaymanta Shmt2), kay tampón tris-EDTA kaqpi 80°C kaqpi (PH 9) kay phatmakunata 25 minutos ruphaykachiy kay ruwaypa rantinpi. Chaymantaqa, secciones nisqakunatam incubarqunku anticuerpo primario nisqawan (qaway Tabla S1) tampón bloqueante nisqapi (3% BSA/PBS) 4°C nisqapi huk tuta kuyurichispa. Paqaristinmi, secciones nisqakunata mayllarqaku tampón bloqueante nisqawan hinaspam incubarqunku chay anticuerpo secundario conjugado con fluoróforo nisqawan 2 horata temperatura ambiente nisqapi; tukukuypiqa, secciones nisqakunatam allinta mayllarqaku PBS nisqapi, contra-tintarqakum DAPI nisqawan, chaymantam AquaPolymount nisqawan allicharqaku Microscopio nisqapi.
Chay muestra nisqa siq’i ruwanapaqmi microscopio confocal de escaneo láser nisqawan (TCS SP8-X utaq TCS Digital Light Sheet, Leica Microsystems) yuraq k’anchay láser nisqawan equipasqa, 405 diodo ultravioleta láser nisqawan ima. Fluoróforota kusichispa chaymanta chay señalta huñuspa Detector Híbrido (HyDs) nisqawan, software LAS-X nisqawanmi huñusqa karqan imaymanakuna pilasqakunata huñunapaq Nyquist muestreo nisqaman hina modo secuencial nisqapi: paneles mana cuantitativos nisqapaqqa, chaymi señales altamente dinámicas (ejemplopaq, células somáticas nisqapi hinallataq dendritas nisqapi) mtYFP) HyD nisqawanmi yachakun hayka PNs nisqakuna kasqanmanta modo BrightR nisqapi). Gating 0,3manta 6 nskama churakun fondo pisiyachinapaq.
Chiqap pacha siq’ikuna t’aqasqa células nisqamanta. Neurobasal-A medio nisqapi 1% B27 suplemento nisqawan 0,5 mM GlutaMax nisqawan t’aqasqa kaptin, chaylla células nisqakunata tarpurqaku diapositivas de vidrio revestidas poli-l-lisina nisqapi (μ-Slide8 Well, Ibidi, catálogo numero 80826) , Chaymantataq 37°C nisqapi hinaspa 5% CO2 nisqapi 1 horata waqaycharqaku, chaynapi células nisqakuna tiyanankupaq. Chiqap pacha imajinas ruwakurqa huk Leica SP8 láser escaneo microscopio confocal equipado huk yuraq láser, HyD, 63×[1.4 apertura numérica (NA)] aceite objetivo lente hinallataq huk calentamiento etapa.
Chay chupataqa utqaylla anestesiarqaku dióxido de carbono nisqawan hinaspam umantapas kuchurqaku, umanchiktam chaylla hurqurqaku uma tullumanta, hinaspam kuchurqaku 200μm rakhupi (13C etiquetado experimentopaq) utaq 275μm rakhupi (iskay foton experimentopaq) sección sagital nisqaman huntasqa kay materialkunawan Helado (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Alemania) huntasqa kachkan kay sustanciakunawan: 125 mM hielo-chiri, carbono-saturado (95% O2 y 5% CO2) pisi Ca2 + líquido cerebroespinal artificial (ACSF) NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM tampón fosfato sódico, 25 mM NaHCO3, 25 mM glucosa, 0,5 mM CaCl2 y 3,5 mM MgCl2 (presión osmótica 310manta 330 mmolkama). Chay uma rebanadas tarisqakunata huk cámara pre-incubación nisqaman apachiy, chaypim aswan hatun Ca2 + ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM tampón fosfato sódico, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glucosa, 1,0 mM CaCl2 y 2,0 mM MgCl2) kachkan. Chawpi) pH 7,4 y 310manta 320 mmolkama).
Imajinas ruwaypiqa, rebanadas nisqakunatam astarqaku huk dedicado sala de imagen nisqaman, chaymantam experimento ruwakurqa perfusión ACSF continua nisqapi 32°manta 33°Ckama temperatura constante nisqapi. Huk microscopio multifotónico láser escaneo (TCS SP8 MP-OPO, Leica Microsystems) nisqawan equipasqa Leica 25x objetivo lente (NA 0.95, yaku), Ti: Zafiro láser (Chameleon Vision II, Coherent) nisqawanmi rebanada nisqa siq’ikuna ruwanapaq. Módulo FLIM (PicoHarp300, PicoQuant) nisqa.
FLIM nisqa Grx1-roGFP2 nisqamanta. Kay cambios kay estado redox citoplasmático kaqpi kay PNs kaqpi tupukurqa kay iskay foton FLIM kaqwan kay sagital cerebro rebanadas kaqpi, maypichus kay Grx1-roGFP2 biosensor PNs kaqman dirigirqa. Kay capa PN kaqpi, kay campo de adquisición akllasqa kachkan yaqa 50 kaqmanta 80 μm kaqkama kay rebanada hawa urapi, kay PN viable kaqta (chayqa, mana estructura perlasniyuq utaq kay cambios morfológicos neuronales kaqta kay dendritas kaqpa patanpi) chaymanta kay doble positivo roGFP2 sensor kaqmanta chaymanta kay AAV codificador shRNA PCx kaqmanta utaq kay secuencia control kaqmanta (sapa sapa co-expresaq mCherry kaqmanta). Huk pila siq'ikunata huñuy 2x digital zoom nisqawan [excitación wavelength: 890 nm; 512 nm 512 iñu . Detección: HyD interno, fluoresceína isotiocianato (FITC) filtro qutu] chaymanta 2manta 3 minutos ukhupi siq’i promedio ruwaywan ima, suficiente fotones huñusqa kananpaq (1000 fotones tukuyninpi) curva churanapaq. Kay sensibilidad kay sonda Grx1-roGFP2 kaqmanta chanta kay verificación kay FLIM kaqmanta condiciones kaqmanta ruwakurqa kay roGFP2 kaqpa valor de vida kaqmanta qhawaspa kay exógeno 10 mM H2O2 yapasqa kay perfusión ACSF kaqman (oxidación aswan hatun kananpaq, kaytaq aswan kawsayta tukuchin), chaymanta kay 2 mM ditiotreitol yapaypi (mixiyachin kay grado de reducción kaqmanta, kaytaq huk pisiyayman tukuchin kawsay pachapi) (S8 siqi, Dmanta Gkama). FLIMfit 5.1.1 software nisqawanmi llamk’achiy chay tarisqakunata t’aqwinapaq, llapan siq’ipa sapallan ismuynin exponencial curva nisqa tupusqa IRF nisqaman (instrumento kutichiy ruway) tupachiy, χ2 nisqataq yaqa 1. Huklla PN nisqapa kawsayninta yupanapaqqa, nervio cuerpo muyuriqpi mascara nisqatam makiwan siq’irqaku, chaymantam sapa mascarapi promedio kawsayninta cuantificación nisqapaq churarqaku.
Análisis de potencial mitocondrial nisqa. Chay sección aguda nisqa 100 nM TMRM nisqawan chiqanmanta yapasqa ACSF perfundido nisqaman 30 minutos incubasqa kaptin, PNs nisqapa cambios potencial mitocondrial nisqa iskay foton microscopio nisqawan tupusqa karqa. TMRM imajinas ruwakurqa sondata 920 nm nisqapi excitaspa chaymanta HyD interno (tetrametilrodamina isotiocianato: 585/40 nm) nisqawan señalkunata huñunapaq; kikin excitación onda nisqawan ichaqa hukniray ukhu HyD (FITC :525/50) nisqawan mtYFP nisqa siq’i ruwanapaq. ImageJ kaqpa Image Calculator plugin kaqwan llamk'achiy mitocondrial atiyta chaninchaypaq sapalla célula nivel kaqpi. Pisi rimayllapi, chay ecuación plug-in: señal = min (mtYFP, TMRM) nisqawanmi riqsichikun chay región mitocondrial nisqa, chaymi qawachin TMRM señalta Purkinje Somali simipi chay huk pila confocal nisqapi chay canal correspondiente nisqapi. Chaymantaqa chay área de pixel nisqa chay mascara ruwasqapi cuantificasqa, chaymanta normalizasqa chay correspondiente umbral sapalla pila nisqa siq’ipi chay canal mtYFP nisqapi chay fracción mitocondrial nisqa tarinapaq chay potencial mitocondrial nisqa rikuchiq.
Chay siq'iqa Huygens Pro (Scientific Volume Imaging) nisqa software nisqawanmi desconvolucionasqa karqan. Azulejokunap escaneasqa siq'inkunapaqqa, huklla azulejopa montaje nisqa ruwakun algoritmo automático de costura nisqawan, LAS-X software nisqawan qusqa. Siqi calibración kaqmanta, ImageJ chaymanta Adobe Photoshop llamk'achiy aswan siq'ita ruwanapaq chaymanta huklla k'anchayta chaymanta chiqanchayta allichaypaq. Adobe Illustrator nisqawanmi siq'ikunata wakichiy.
mtDNA nisqamanta enfoque nisqamanta t’aqwiy. Kay yupay lesiones de ADNmt kaqmanta yupasqa karqa kay secciones cerebelosas kaqpi etiquetadas kay anticuerpos kaqwan kay ADN kaqmanta kay microscopio confocal kaqwan. Sapa área diana ruwasqa karqan celula cuerpopaq hinallataq sapa célulaq núcleonpaq, chaymanta chay área respectiva yupasqa karqan Multi Measure plug-in (software ImageJ) nisqawan. Celularpa kurkunpa suyunmanta nuclear nisqa suyuta qichuy, citoplasmático nisqa suyuta tarinapaq. Tukuyninpiqa, kay Analyze Particles plug-in (ImageJ software) nisqawanmi kikillanmanta yupasqa karqan chay puntos de ADN citoplasmático nisqakuna mtDNA nisqa rikuchiq umbral nisqa siq’ipi, chaymanta chay tarisqakuna normalizasqa karqan PN promedio nisqaman CTRL chupakunamanta. Chay ruwasqakunaqa sapa célula nisqapi nucleósidos nisqakuna hayk’a kasqanwanmi rikuchikun.
Análisis de expresión proteica nisqa. ImageJ kaqpa Image Calculator plugin kaqwan llamk'achiy PN kaqpi expresión proteica kaqmanta chaninchaypaq huk célula nivel kaqpi. Pisi rimayllapi, kay huk capa confocal imagen kaqpi kay correspondiente canal kaqmanta, kay ecuación kaqnintakama: señal = min (mtYFP, anticuerpo), kay región mitocondrial kaqmanta mayqinchus inmunoreactividadta rikuchin huk cierto anticuerpo kaqman kay Purkina kaqpi riqsichikun. Chaymantaqa chay área de pixel nisqa chay mascara ruwasqapi cuantificasqa, chaymanta normalizasqa chay correspondiente umbral sapalla pila nisqa siq’ipi chay canal mtYFP nisqapi chay fracción mitocondrial nisqa chay rikuchisqa proteína nisqamanta tarinapaq.
Purkinje celular densidad nisqamanta t’aqwiy. ImageJ kaqpa Cell Counter plug-in nisqawan Purkinje densidad nisqa chaninchakurqa, Purkinje células yupasqa yupayta rakispa, yupasqa células nisqapa anillo cerebelar nisqapa sayayninwan.
Muestra wakichiy, huñuy ima. Chay umakuna control qutumanta chanta Mfn2cKO chupakunamanta 2% PFA/2,5% glutaraldehído nisqapi 0,1 M tampón fosfato (PB) nisqapi fijasqa karqanku, chaymantataq secciones coronales nisqakunata wakichirqanku ciliatos nisqawan (Leica Mikrosysteme GmbH, Viena, Austria) (Gruesor 50 a 60 μm) Chaymantataq fijarqanku tampón PB nisqapi 1% tetraóxido de os nisqapi chaymanta 1,5% ferrocianuro potasio nisqa temperatura ambiente nisqapi 1 hora. Chay secciones nisqakunatam kimsa kutita mayllarqaku destilada yakuwan, chaymantam 70% etanolwan 1% acetato de uranilo nisqawan 20 minuto tiñirqaku. Chaymantaqa chay secciones nisqakunatam deshidratarqaku alcohol graduado nisqapi hinaspam Durcupan ACM (Araldite casting resin M) epoxi resina (Electron Microscopy Sciences, catálogo numero 14040) nisqapi churarqaku, siliciowan llusisqa vidrio diapositivas nisqakuna chawpipi, chaymantam 60°C nisqapi Polimerizarqaku hornopi 48 horata. Chay corteza cerebelosa nisqapa áreanmi akllasqa karqa hinaspam 50 nm ultrafinas secciones nisqakunata Leica Ultracut (Leica Mikrosysteme GmbH, Viena, Austria) nisqapi kuchurqaku hinaspam 2×1 mm cobre hendidura rejilla nisqapi qatasqa película de poliestireno nisqawan pallarqaku. Chay t’aqakunatan t’inkirqanku 4% acetato de uranilo nisqawan H2O nisqapi 10 minuto, H2O nisqawan askha kutita mayllarqanku, chaymantataq Reynolds citrato de plomo nisqawan H2O nisqapi 10 minuto, chaymantataq H2O nisqawan askha kutita mayllarqanku. Micrografías nisqakunam ruwakurqa microscopio electrónico de transmisión Philips CM100 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE.UU.) nisqawan, TVIPS (Tietz Video and Image Processing System) TemCam-F416 digital cámara (TVIPS GmbH, Gauting, EE.UU.) nisqawan. Alemania).
AAV kaqwan infectasqa chupakunapaq, uma t’aqasqa karqa chanta 1 mm rakhu sección sagital kaqpi kuchusqa karqa, chanta cerebelota microscopio de fluorescencia kaqwan qhawasqa karqa kay AAV-infectado anillo kaqta riqsichinapaq (chayqa, mCherry expresaq). Experimentokunalla maypichus AAV inyección huk ancha hatun eficiencia transducción kaqpi kay capa celular Purkinje kaqmanta (kayqa yaqa tukuy capa kaqmanta) iskay qatiq anillo cerebeloso kaqpipas llamk’achikun. Chay AAV-transducido bucle nisqa microdiseccionasqa karqan huk tuta post-fijación nisqapaq (4% PFA y 2,5% glutaraldehído 0,1 M tampón de cocoato nisqapi) chaymanta aswanta ruwasqa karqan. EPON churasqa kananpaqqa, chay takyasqa tejido nisqatam mayllarqaku 0,1 M tampón de cocoato sódico nisqawan (Applichem), hinaspam 2% OsO4 (os, Servicios de Ciencias; Caco) nisqawan 0,1 M tampón de cocoato sódico (Applichem) nisqapi 4 Horas incubarqunku, chaymantam mayllarqaku 2 horata. 3 kutita yapamanta ruwana 0,1 M cocamida tampón nisqawan. Chaymantaqa, serie ascendente de etanol nisqawanmi sapa etanolpa solucionninta 4°C nisqapi 15 minuto incubasqata churarqaku, chaynapi chay tejido nisqa deshidratado kananpaq. Chay tejidotaqa óxido de propileno nisqamanmi aparqaku hinaspam huk tuta EPON (Sigma-Aldrich) nisqapi 4°C nisqapi incubarqunku. Chay tejidota churana musuq EPON nisqapi temperatura ambiente nisqapi 2 horasta, chaymantataq 62°C nisqapi 72 horata churana. Ultramicrotomo (Leica Microsystems, UC6) nisqawan, diamante cuchillowan (Diatome, Biel, Suiza) 70 nm ultrafina secciones nisqakunata kuchuna, hinaspa 1,5% acetato de uranilo nisqawan 15 minuto 37°C nisqapi manchana, hinaspa 4 minuto citrato de plomo nisqawan ch’aqchuy. Chay micrografías electrónicas nisqakunaqa ruwakurqa JEM-2100 Plus transmisión electron microscopio (JEOL) nisqawanmi, Camera OneView 4K 4K 16-bit (Gatan) nisqawan, DigitalMicrograph software nisqawan (Gatan) nisqawan. Análisis nisqapaqqa, micrografías electrónicas nisqakunatam 5000× utaq 10.000× zoom digital nisqawan hapirqaku.
Mitocondrias nisqamanta anlisis morfológico nisqa. Llapan anlisiskunapaqmi, sapa mitocondrias nisqapa contornonkuna makiwan ruwasqa karqa digital imaymanakunapi ImageJ software nisqawan. Chikan chikan parmetros morfológicos nisqakunam qawarisqa. Densidad mitocondrial nisqataqa pachakmanta hukninmi sapa celulapa llapan mitocondrial nisqa kayninta rakispa citoplasma nisqapa áreanwan (área citoplasma = área celular-área núcleo celular) × 100. Mitocondrias nisqapa muyu kayninqa yupasqam kay fórmula nisqawan [4π∙(área/perímetro 2)]. Mitocondrias nisqapa ista morfología nisqanmi qawarisqa karqa hinaspam iskay categoriapi (“tubular” hinaspa “blister”) rakisqa karqa, hatun rikchayninman hina.
Autofagosoma/lisosoma yupay chaymanta densidad nisqamanta análisis. ImageJ software nisqawan makiwan sapa autofagosoma/lisosoma nisqapa contornonkunata digital nisqapi qawachinapaq. Autofagosoma/lisosoma nisqa área nisqa sapa pachakmanta yupasqa hina sapa célula nisqapa llapan autofagosoma/lisosoma estructura nisqa área nisqa citoplasma nisqapa área nisqawan rakispa (área citoplasma=área celular-área núclea)×100 nisqawan. Autofagosomas/lisosomas nisqap densidadninqa yupasqam, llapan yupayta rakispa, hayk'a autofagosoma/lisosoma estructuras nisqakuna sapa célula nisqapi (área citoplasmática nisqapi) (área citoplasmática = área celular-área nuclear).
Etiquetado seccionamiento agudo nisqapaq chaymanta muestra wakichiypaq. Experimentokuna glucosa nisqamanta etiquetado nisqapaq, chay agudo cerebro rebanadas nisqakunata huk cámara pre-incubación nisqaman apachiy, chaypim carbono saturado (95% O2 y 5% CO2), alto Ca2 + ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM tampón fosfato sódico, 25,0 mM NaHCO 3, 25,0 mM d-glucosa, 1,0 mM CaCl 2 y 2,0 mM MgCl 2, pH 7,4 y 310manta 320 mOsmkama allinchasqa), maypichus glucosa 13 C 6- Glucosa sustitución (Eurisotop, catálogo yupay CLM-1396). Experimentokunapaq mayqinkunachus piruvato etiquetadota munanku, chay agudo cerebro phatmakunata aswan hatun Ca2 + ACSF nisqaman (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM tampón fosfato sódico, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glucosa, 1,0 mM CaCl2 nisqaman yapay MgCl2, pH 7,4 kaqman chanta 310 kaqman 320mOsm kaqman allinchay, chanta 1mM 1-[1-13C]piruvato (Eurisotop, catálogo yupay CLM-1082) yapay. Chay t’aqakunataqa 90 minutu 37°C nisqapi incubar. Chay experimento tukukuptinqa, chay secciones nisqakunatam utqaylla mayllarqaku yakuyuq soluciónwan (pH 7,4) 75 mM carbonato de amonio nisqawan, chaymantam homogeneizarqaku 40:40:20 (v:v:v) acetonitrilo (ACN): metanol: yakupi. Chay secciones nisqakunata hielopi 30 minuto incubasqa kaptin, muestrakunata centrifugarqaku 21.000 g nisqapi 10 minuto 4°C nisqapi, chaymantam chuya sobrenadante nisqataqa concentrador SpeedVac nisqapi chakichirqaku. Chay ch’akisqa metabolito pellet nisqataqmi -80°C nisqapi waqaychasqa karqa análisis nisqakama.
Análisis de cromatografía líquida-espectrometría de masas nisqa 13 C-etiquetado aminoácidos nisqamanta. Análisis de cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS) nisqapaqmi, chay pellet metabolito nisqataqa 75μl LC-MS grado yakupi (Honeywell) kaqmanta suspendirqaku. 21.000 g nisqapi 5 minuto 4°C nisqapi centrifugacion ruwasqamantaqa, 20 μl chuyanchasqa sobrenadante nisqatam anlisis de flujo de aminoácidos nisqapaq churarqaku, puchuq extractotañataqmi chaylla análisis aniónico nisqapaq churarqaku (urapi qaway). Análisis de aminoácidos ruwakurqa ñawpaq willasqa protocolo de derivación cloruro de benzoilo nisqawan ( 55 , 56 ). Ñawpaq kaq ruwaypiqa, 10μl carbonato sódico 100 mM (Sigma-Aldrich) nisqatam 20μl extracto de metabolito nisqaman yapaykurqaku, chaymantam 10μl cloruro de benzoilo 2% (Sigma-Aldrich) nisqatapas yaparqaku ACN grado LC nisqaman. Chay muestrataqa pisillatam vortex nisqawan ruwarqaku, chaymantam centrifugarqurqaku 21.000 g nisqapi 5 minuto 20°C nisqapi. Chay chuyanchasqa hawa yakuta huk 2 ml automuestreador vialman huk inserto de vidrio cónico (200 μl volúmen) nisqawan apachina. Chay muestrakunam qawarisqa karqa Acquity iClass ultra-alto rendimiento LC sistema (Waters) nisqawan, chaymi tinkisqa kachkan Q-Exactive (QE)-HF (Ultra High Field Orbitrap) nisqawan espectrómetro de masas de precisión de alta resolución nisqawan (Thermo Fisher Scientific). Análisis nisqapahqa, 2μl muestra derivada nisqatam inyectarqaku 100×1,0 mm columna T3 de sílice de alta kallpayuq (Yaku) nisqaman, chaypim 1,8μm particulakuna karqa. Chay caudal nisqa 100μl/min, chaymantatahmi chay sistema de tampón nisqa tampón A (10 mM formato de amonio y 0,15% ácido fórmico yakupi) chaymanta tampón B (ACN) nisqamanta. Gradiente nisqa kayhinam: 0%B 0 minutupi; 0%B. 0manta 15% Bkama 0manta 0,1 minutokama; 15manta 17% Bkama 0,1manta 0,5 minutokama; B 17manta 55%kama 0,5manta 14 minutokama; B 55manta 70%kama 14manta 14,5 minutokama; 14,5manta 70manta 100%kama B 18 minutospi; 100% B 18manta 19 minutokama; 100manta 0% B 19manta 19,1 minutokama; 0% B 19,1manta 28 minutokama (55, 56). QE-HF espectrómetro de masas nisqa llamkanmi ionización positiva nisqapi, m/z (ratio masa/carga) nisqawan 50manta 750. Chay resolución aplicada nisqa 60.000, chaymanta control de ganancia (AGC) nisqa ionkunapa diana nisqa tarisqa 3×106, chaymantam ionkunapa tiempo máximo nisqa 100 milisegundos nisqa. Chay ionización electrospray ruphaykachisqa (ESI) nisqapa paqariyninqa 3,5 kV nisqa voltaje de pulverización nisqapim llamkan, 250°C nisqapi capilar nisqapi, 60 AU nisqapi vaina nisqapi wayrapa puriyninpi (unidades arbitrarias nisqapi), 20 AU nisqapi yanapaq wayrapa puriyninpipas. 250°C nisqapi. S lenteqa 60 AU nisqamanmi churasqa kachkan.
Análisis de cromatografía aniónica-MS nisqa 13C nisqawan sutichasqa ácidos orgánicos nisqamanta. Chay puchuq metabolito precipitado (55μl) nisqatam qawarirqaku sistema de cromatografía iones Dionex (ICS 5000+, Thermo Fisher Scientific) nisqawan, chaymi espectrómetro de masas QE-HF (Thermo Fisher Scientific) nisqawan tinkisqa karqa. Pisi rimayllapi, 5μl metabolito extracto nisqatam inyectarqaku Dionex IonPac AS11-HC columnaman HPLC nisqawan equipasqa (2 mm×250 mm, particulapa sayaynin 4μm, Thermo Fisher Scientific) nisqawan, modo de bucle parcial push-in nisqapi, 1. )on nisqawan huntachiywan. Dionex IonPac AG11-HC guardia columna (2 mm x 50 mm, 4μm, Thermo Fisher Scientific) nisqa. Chay columna nisqapa temperaturanmi 30°C nisqapi waqaychasqa kachkan, chaymantam automuestreador nisqapas 6°C nisqapi churasqa kachkan. Huk cartucho de hidróxido de potasio nisqawan, yaku desionizada nisqawan qusqa, gradiente de hidróxido de potasio nisqawan, chay generador de eluyente nisqawan. Metabolitos nisqakuna rakiy 380μl/min caudal nisqapi, kay gradiente nisqawan: 0manta 3 minutokama, 10 mM KOH; 3manta 12 minutokama, 10manta 50 mM KOHkama; 12manta 19 minutokama, 50manta 100 mM KOHkama; 19 21 minutukama , 100 mM KOH; 21manta 21,5 minutokama, 100manta 10 mM KOHkama. Chay columnataqa 10 mM KOH nisqawanmi 8,5 minutos yapamanta equilibrarqaku.
Chay metabolitos eluidos nisqakunam hukllawakunku 150μl/min isopropanol suplemento corrientewan columnamanta qipaman chaymantam diriginku huk espectrómetro de masas de alta resolución nisqaman, chaymi llamkachkan modo de ionización negativa nisqapi. MSqa qawarichkanmi masapa kayninta m/z 50manta 750kama 60.000 resolución nisqawan. AGC nisqaqa 1×106 nisqamanmi churasqa, chaymantataqmi aswan hatun ion pachaqa 100 ms nisqapi waqaychasqa. Chay ruphay ESI nisqa fuenteqa 3,5 kV nisqa voltaje de pulverización nisqapim llamkachisqa. Ion pukyupa huk churakuyninkunaqa kayhinam: kapilar ruphay 275°C; vaina gaspa puriynin, 60 AU; yanapaq gaspa puriynin, 20 AU 300°C nisqapi, S lente nisqapa 60 AU nisqaman churasqa.
Análisis de datos nisqa metabolitos etiquetados 13C nisqamanta. TraceFinder software (versión 4.2, Thermo Fisher Scientific) nisqawanmi isótopos nisqapa ratio nisqamanta willakuykunata qawarinapaq. Sapa compuesto nisqapa identidadninqa chiqapchasqam karqa confiable compuesto de referencia nisqawan, chaymantam sapanmanta qawarisqa karqa. Análisis de enriquecimiento isótopos nisqa ruwanapaqmi, sapa 13C isótopo (Mn) nisqapa cromatograma iónico extraído (XIC) nisqapa árean hurqusqa karqa [M + H] + nisqamanta, chaypim n nisqa carbono nisqa yupay chay compuesto diana nisqamanta, chaywanmi aminoácidos nisqakunata qawarinchik utaq [ MH] + nisqawanmi aniones nisqakunata qawarinchik. XICpa masa exactitudninqa aswan pisim pichqa partes por millonmanta, chaymanta RTpa exactitudninqa 0,05 minutos. Chay anlisis de enriquecimiento nisqa ruwakun sapa tarisqa isótopo nisqapa ratio nisqawan chay tupaqnin compuesto nisqapa llapallan isótopos nisqapa huñukuyninwan. Chay ratios nisqakunaqa sapa isótopo nisqapaqmi sapa pachakmanta valores nisqa hina qusqa, chaymantam chay ruwasqakunaqa expresasqa kanku enriquecimiento porcentual molar (MPE) nisqapi, ñawpaq willakusqanman hina (42).
Chay congelado neurona pellet nisqa homogeneizasqa karqa hielo hina chiri 80% metanol (v/v) nisqapi, vortex nisqawan, hinaspa -20°C nisqapi 30 minuto incubasqa. Yapamanta muestrata vortex nisqawan +4°C nisqapi 30 minutukunata kuyurichiy. Chay muestraqa centrifugasqam karqa 21.000 g 5 minuto 4°C nisqapi, chaymantam chay sobrenadante nisqa huñusqa hinaspa ch’akichisqa karqa concentrador SpeedVac nisqawan 25°C nisqapi qatiqnin anlisis ruwanapaq. Imaynan ñawpaqpi willakurqa hina, análisis LC-MS ruwakurqa chay aminoácidos nisqapi chay células clasificadas nisqapi. TraceFinder (versión 4.2, Thermo Fisher Scientific) nisqawanmi ruwakurqa sapa compuesto nisqapa masa monoisótópica nisqawan. Normalización cuantil kay metabolito kaqmanta willaykunamanta ruwakurqa kay preprocessCore software paquete kaqwan ( 57 ).
Rebanada wakichiy. Chay chupataqa utqayllam dióxido de carbono nisqawan anestesiarqaku hinaspam umantapas kuchurqaku, umanchiktam chaylla hurqurqaku uma tullumanta, chaymantam hielowan huntasqa kuyuriq cuchillowan (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Alemania) 300manta 375 μm secciones sagitales nisqaman kuchurqaku Gasificación de carbono chiri (95% O2 hinaspa 5% CO2) Pisi Ca2 + ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM tampón fosfato sódico, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glucosa, 1,0 mM CaCl2 y 6,0 mM MgCl2 pH 7,4 nisqaman, 310manta 330 mOsmkama allinchay). Chay uma rebanadas tarisqakunata huk cámara nisqaman apachina, chaypim aswan hatun Ca2 + ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM tampón fosfato sódico, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glucosa, 4,0 mM CaCl2 hinaspa mM 3,5 MgCl2) pH 7,4 hinaspa 310manta 320 mOsmkama). Chay phatmakunataqa 20 30 minutokama waqaychay, chhaynapi manaraq grabashaspa kutichipunanpaq.
grabacionta ruwaspa. Tukuy grabacionkunapaqmi microscopio etapa nisqawan equipasqa karqa, chaymi equipasqa karqa cámara de grabación fija nisqawan, chaynallataq lente objetivo de inmersión 20x nisqawan (Scientifica). Kay putativas células Purkinje kaqta riqsichikurqa (i) cuerpop sayayninwan, (ii) kay cerebelo anatómica tarikuyninwan, chanta (iii) expresión kay gen fluorescente mtYFP willakuqwan ima. Chay parche pipeta 5manta 11 megohms punta resistenciayuqqa hurqusqam huk capilar de vidrio borosilicato (GB150-10, 0,86 mm×1,5 mm×100 mm, Science Products, Hofheim, Alemania) chaymanta huk pipeta horizontal Instruments (P-1000, Sutter), Novato, CA). Llapan grabacionkuna ruwasqa karqan ELC-03XS npi parche abrazadera amplificador (npi electronic GmbH, Tam, Alemania), chaymi controlasqa karqan software Signal (versión 6.0, Cambridge Electronic, Cambridge, Reino Unido). Chay experimentoqa grabasqa karqan 12,5 kHz tasa de muestreo nisqapi. Chay señalqa iskay filtros de Bessel corto-paso nisqawanmi filtrasqa kachkan, chay frecuencias de corte nisqawanmi 1,3 hinaspa 10 kHz nisqa. Membranapa, pipetapa capacitancianqa amplificador nisqawanmi circuito de compensación nisqawanmi compensado. Llapan experimentokuna ruwakurqa Orca-Flash 4.0 cámara (Hamamatsu, Gerden, Alemania) nisqapa kamachisqan, chaymi Hokawo software nisqawan kamachisqa karqa (versión 2.8, Hamamatsu, Gerden, Alemania).
Rutina tukuy célula nisqa ruway hinaspa análisis nisqa. Manaraq grabachkaspa chaylla, pipetaman huntachisun chay solucion interna nisqawan, chaypim kachkan kay sustanciakuna: 4,0 mM KCl, 2,0 mM NaCl, 0,2 mM EGTA, 135,0 mM gluconato de potasio, 10,0 mM Hepes, 4,0 mM ATP (Mg), 0,5 mM Guanosina trifosfato (GTP) (Na) y 10,0 mM creatinina fosfato nisqatam pH 7,25 nisqaman allicharqaku, chaymantam presión osmótica nisqa 290 mOsm (sacarosa) nisqa karqa. Chaylla 0 pA kallpata churaspa chay membrana rupturananpaq, chaymi tupusqa karqan chay membrana samaq potencial. Chay yaykusqa harkakuyqa tupukunmi -40, -30, -20, -10 pA nisqa hiperpolarizada nisqa corrientekunata churaspa. Voltaje kutichiypa hatun kayninta tupuy hinaspa Ohmpa kamachikuyninwan yaykusqa harkakuy yupanapaq. Espontánea actividadqa registrakurqa abrazadera de tensión nisqapi 5 minutos nisqapi, chaymantam sPSC nisqa riqsichisqa hinaspa tupusqa karqa Igor Pro nisqapi (versión 32 7.01, WaveMetrics, Lake Oswego, Oregon, USA) huk script de reconocimiento semiautomático nisqawan. Chay IV kurva nisqapas, corriente de estado estacionario nisqapas tupusqam, pilata hukniray potencialkunapi (-110 mV nisqamanta qallarispa) abrazadera nisqawan, chaymanta 5 mV nisqa llamkaykunapi voltaje nisqa yapaspa. AP ruwayqa pruebasqa karqan huk corriente despolarizante nisqawan. Célulata -70 mV nisqapi abrazadera nisqawan, pulso de corriente despolarizante nisqawan churachkaspa. Sapa unidad de grabación nisqapa paso sayayninta sapakamata allichay (10manta 60 pAkama). Yupay AP aswan hatun frecuenciata makiwan yupaspa pulso spikes nisqakunata aswan hatun AP frecuenciata ruwaq. Chay umbral AP nisqataqa qawarikunmi iskay kaq derivado nisqawan chay pulso de despolarización nisqawan, chaymi ñawpaqtaqa huk utaq achka AP nisqakunata llamkachin.
Perforado parche configuración y análisis. Ruway perforado parche grabacionta protocolokuna estándar kaqwan. Pipeta mana ATP- y GTP nisqayuqta llamk’achiy, mana kay ingredientes nisqayuq: 128 mM gluconato K, 10 mM KCl, 10 mM Hepes, 0,1 mM EGTA y 2 mM MgCl2, hinaspa pH 7,2 nisqaman allinchay (KOH nisqawan). ATP chaymanta GTP kaqkunaqa kay solución intracelular kaqmanta saqisqa kanku kay mana controlada permeabilidad kay membrana celular kaqmanta hark’anapaq. Chay pipeta de parche nisqa hunt’achisqa kan huk anfotericina nisqayuq ukhu solución nisqawan (yaqa 200manta 250 μg/ml; G4888, Sigma-Aldrich) chay perforado parchemanta registrota tarinapaq. Anfotericinataqa sulfóxido de dimetil nisqapim chulluchirqaku (tukupay concentración: 0,1manta 0,3%kama; DMSO; D8418, Sigma-Aldrich). Kay concentración kay DMSO llamk’achisqa mana huk significativo efectota ruwarqachu kay neuronas estudiasqa kaqpi. Chay punzonado ruwaypiqa, resistencia de canal (Ra) nisqatam sapa kuti qawarirqaku, chaymantam experimentoqa qallarirqaku Rapa, APpa amplitudnin estabilizasqa kaptin (20-40 minutos). Actividad espontánea nisqa tupukun huk abrazadera de tensión nisqapi chaymanta/utaq corriente nisqapi 2manta 5 minutokama. Willakuykuna t’aqwiyqa ruwakurqa Igor Pro (7.05.2 kaq laya, WaveMetrics, EE.UU.), Excel (2010 kaq laya, Microsoft Corporation, Redmond, EE.UU.) chaymanta GraphPad Prism (8.1.2 kaq laya, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA) kaqwan. Hukllachasqa Amirika Suyukuna). APs espontáneos riqsichinapaq, IgorPro kaqpa NeuroMatic v3.0c plugin kaqninta llamk'achin. Kikinmanta APkunata riqsichiy huk qusqa umbral kaqwan, sapankama sapa registropaq allichasqa. Chay spike intervalo nisqawanmi, chay spike frecuenciata tariy chay máxima instantánea spike frecuenciawan chaymanta promedio spike frecuenciawan.
PN aislamiento nisqa. Ñawpaq qillqasqa protocoloman adaptakuspa, PNs chuyanchasqa karqa kay cerebelo de ratamanta huk etapa especificada kaqpi ( 58 ). Pisi rimayllapi, cerebelota diseccionaspa, hielo-chiri medio de disociación nisqapi picado karqa [mana HBSS Ca2+ nisqawan Mg2+ nisqawan, 20 mM glucosawan, penicilinawan (50 U/ml) chanta estreptomicinawan (0,05 mg/ ml) yapasqawan], chaymantataq chay mediota papapi [HBSS, 1-cisteína·HCl nisqawan yapasqa (1 mg / ml), papaína (16 U / ml) y desoxirribonucleasa I (ADNasa I; 0,1 mg/ml)] 30 minutu 30°C nisqapi hampina. Ñawpaqtaqa mayllana chay tejidos nisqakunata medio HBSS nisqapi, chaypim kachkan huevo mucosidad (10 mg/ml), BSA (10 mg/ml) hinaspa DNasa (0,1 mg/ml) nisqa temperatura ambiente nisqapi, chaynapi digestión enzimática nisqa mana kananpaq, chaymantañataqmi chay medio HBSS nisqapi, chaypim 20 mM glucosa nisqa kachkan Sumaqllata muyuchispa HBSS, penicilina (50 U/ml), estreptomicina (0,05 mg/ml) hinaspa ADNasa (0,1 mg/ml) huklla células nisqakunatam kacharin. Chay suspensión celular ruwasqamanta filtrasqa karqa 70μm tamizador celularwan, chaymantam células nisqakunata centrifugaciónwan (1110 rpm, 5 minutos, 4°C) pelletarqaku hinaspam medio de clasificación nisqapi [HBSS, suplementado 20 mM glucosa, 20% fetal bovino ) Suero, penicilina (50 U/ml) hinaspa estreptomicina nisqapi (0,05 mg/ml)]; chaninchay viabilidad celular kaqta yoduro de propidio kaqwan chanta kay densidad celular kaqta 1×106 kaqmanta 2×106 células/ml kaqman allinchay. Manaraq citometría de flujo nisqa ruwakuchkaptinqa, suspensión nisqatam filtrarqaku 50 μm colador celular nisqawan.
Citometro de flujo nisqa. Células clasificación nisqa ruwakurqa 4°C nisqapi FACSAria III makinawan (BD Biosciences) chaymanta FACSDiva software nisqawan (BD Biosciences, versión 8.0.1). Chay suspensión celular nisqa t’aqasqa karqan 100 μm boquilla nisqawan 20 psi nisqa presión nisqapi ~2800 eventos/seg. Kay criterios tradicionales de gating (tamaño celular, discriminación bimodal, chanta características de dispersión) mana asegurayta atinkuchu kay chiqan aislamiento kay PN kaqmanta huk tipos celulares kaqmanta, kay estrategia gating kaqmanta churasqa kachkan kay directa comparación kaqpi kay YFP intensidad kaqmanta chanta kay autofluorescencia kaqmanta kay mitoYFP+ ​​kaqpi chanta kay control mitoYFP − Ratones kaqpi. YFPqa kusikunmi chay muestrata irradiaspa 488 nm láser chiruwan, chaymantam chay señalqa tarikun 530/30 nm banda paso filtrowan. MitoYFP+ ​​chupakunapiqa, kay Rosa26-mitoYFP willakuq genpa relativa kallpanpas llamk’achisqallataqmi neuronal cuerpota hinaspa axónico fragmentokunata sapaqchanapaq. 7-AAD nisqaqa 561 nm q’illu láser nisqawanmi kusichisqa, 675/20 nm nisqa filtro de paso de banda nisqawantaqmi tarikun wañusqa células nisqakuna mana kananpaq. Chay pachallapi astrocitos nisqakunata rakinapaqmi, suspensión celular nisqataqa ACSA-2-APC nisqawan tintarqaku, chaymantam muestrataqa 640 nm linea láser nisqawan irradiarqaku, chaymantam filtro de paso de banda 660/20 nm nisqawan chay señalta riqsirqaku.
Chay huñusqa células nisqakunatam centrifugación nisqawan pellet ruwarqaku (1110 rpm, 5 minutos, 4°C) hinaspam -80°C nisqapi waqaychasqaku llamkanankama. Mfn2cKO chupakuna chaymanta paykunapa litter allquchakuna kikin p’unchawpi clasificasqa kanku kay variabilidad procesal kaqta pisiyachinapaq. FACS nisqamanta willakuykunata riqsichiypas, t’aqwiypas ruwakurqa FlowJo software (FlowJo LLC, Ashland, Oregon, EE.UU.) nisqawanmi.
Imaynatachus ñawpaqpi nisqanchik (59), chiqa pacha PCR llamk’achikun ADNta t’aqanapaq kay t’aqasqa neuronasmanta kay qhipaman mtDNA yupaypaq. Kay linealidad chaymanta sensibilidad umbral kaqmanta qallariyninpi pruebasqa karqa kay qPCR purichispa hukniray yupay células kaqpi. Pisi rimayllapi, huñuna 300 PN huk tampón de lisis nisqapi, chaymi 50 mM tris-HCl (pH 8,5), 1 mM EDTA, 0,5% Tween 20 hinaspa proteinasa K (200 ng/ml) nisqamanta, hinaspa 55°C nisqapi 120 minuto incubar. Chay células nisqakunataqa astawanmi incubarqunku 95°C nisqapi 10 minutos, chaynapi proteasa K nisqapa inactivación completa nisqa kananpaq, chaymi huk sonda TaqMan (Thermo Fisher) nisqawan específicas mt-Nd1 nisqapaq, ADNmt nisqa tupusqa karqa PCR semicuantitativa nisqawan sistema PCR 7900HT Real-Time PCR nisqapi (Thermo Fisher Scientific). Ciencia, catálogo yupay Mm04225274_s1), mt-Nd6 (Thermo Fisher Scientific, catálogo yupay AIVI3E8) chaymanta 18S (Thermo Fisher Scientific, catálogo yupay Hs99999901_s1) genes.
Proteoma muestra wakichiy. Chay solucionta 95°C nisqapi 10 minuto ruphaykachispa, sonicacionwan ima, tampón de lisis nisqapi [6 M cloruro de guanidina, 10 mM clorhidrato de tris(2-carboxietil) fosfina, 10 mM cloroacetamida hinaspa 100 mM tris- Lyse congelado neurona pellets HCl nisqapi]. Bioruptor (Diagenode) nisqapi 10 minuto (30 segundos pulso / 30 segundos pausa periodo). Chay muestraqa 1:10 20 mM tris-HCl (pH 8,0) nisqapi diluisqa, 300 ng tripsina quriwan (Promega) chaqrusqa, hinaspa huk tuta 37°C nisqapi incubasqa, huntasqa digestión nisqaman chayananpaq. Iskay kaq punchawpiqa, muestratam centrifugarqaku 20.000 g nisqapi 20 minuto. Chay hawa yakutaqa 0,1% ácido fórmico nisqawanmi diluirqunku, chaymantam chay solucionta desaltarqaku kikinmanta ruwasqa StageTips nisqawan. Chay muestraqa ch’akichisqa karqan huk instrumento SpeedVac nisqapi (concentrador de Eppendorf más 5305) 45°C nisqapi, chaymantataqmi chay péptido nisqataqa 0,1% ácido fórmico nisqapi suspendirqanku. Llapan muestrakunataqa huk kutillapim huk runalla ruwarqa. Astrocitos muestrakunata qawarinapaqmi, 4 μg péptidos desaltado nisqakunata etiquetarqaku etiqueta de masa tándem nisqawan (TMT10plex, catálogo numero 90110, Thermo Fisher Scientific) 1:20 péptidowan reactivo TMTwan. TMT etiquetadopaqqa, 0,8 mg reactivo TMT nisqatam 70 μl ACN anhidro nisqapi musuqmanta suspendirqaku, chaymantam ch’akisqa péptido nisqataqa 9 μl 0,1 M TEAB (bicarbonato de trietilamonio) nisqaman musuqmanta ruwarqaku, chaymanmi yaparqaku 7 μl reactivo TMT nisqa ACN nisqapi. Chay concentración nisqa 43,75% nisqa. 60 minuto incubacionmanta, chay reacción nisqataqa 2 μl 5% hidroxilamina nisqawanmi wañuchirqaku. Chay etiquetado péptidos nisqakunatam huñurqaku, chakichirqaku, 200μl ácido fórmico 0,1% (FA) nisqapi kaqmanta suspendirqaku, iskayman rakirqaku, chaymantam desaltarqaku kikinmanta ruwasqa StageTips nisqawan. UltiMate 3000 ultra alto rendimiento líquido cromatógrafo (UltiMate 3000 ultra alto rendimiento líquido cromatógrafo) nisqawan, iskay kuskanmanta hukninmi fraccionasqa karqa 1mm x 150mm Acquity cromatográfica columnapi huntasqa 130Å1.7μm C18 particulakunawan (Waters, catálogo No. SKU: 186006935). Termo Fisher Científico nisqa). Péptidos nisqakunata t’aqana 30μl/min caudal nisqapi, t’aqana 1%manta 50% tampón B nisqamanta 85 minutos gradiente a paso 96 minutos nisqawan, 50%manta 95% tampón B nisqakama 3 minutos, chaymantataq 8 minutos 95 % Tampón B nisqapaq; Tampón A nisqaqa 5% ACN nisqawan 10 mM bicarbonato de amonio (ABC) nisqawanmi, B tampón nisqataq 80% ACN nisqawan 10 mM ABC nisqawan. Sapa 3 minutumanta fracciones nisqakunata huñuspa iskay huñupi (1 + 17, 2 + 18, hukkunapas) huñuspa centrífuga de vacío nisqapi ch’akichina.
LC-MS/MS nisqawan t’aqwiy. Espectrometría de masas nisqapaqqa, chay péptidos (numero r119.aq) nisqakunatam rakirqaku 25 cm, 75 μm diámetro ukunpi PicoFrit columna analítica nisqapi (musuq lente objetivo, parte yupay PF7508250) equipasqa 1,9 μm ReproSil-Pur 120 C18-AQ mediowan (Dr. Maisch, mat), EASY-nLC nisqawan 1200 watapi (Thermo Fisher Scientific, Alimanyapi). Chay columnataqa 50°C nisqapim waqaycharqaku. Tampón A y B nisqakunaqa 0,1% ácido fórmico nisqa yakupi, 0,1% ácido fórmico nisqa 80% ACN nisqapi, chayman hina. Péptidos nisqakunam rakisqa karqa gradiente a paso 200 nl/min nisqawan 6%manta 31% tampón Bkama 65 minutos, chaymanta 31%manta 50% tampón Bkama 5 minutos. Chay eluido péptidos nisqakunam espectrómetro de masas Orbitrap Fusion (Thermo Fisher Scientific) nisqawan qawarisqa karqa. Péptido precursor m/z tupuyqa ruwakun 120.000 resolución nisqawan 350manta 1500 m/zkama. 27% normalizada colisión energía nisqawanmi, aswan kallpasapa precursor nisqa 2manta 6kama carga estado nisqayuqmi akllasqa kanqa hatun kallpayuq C trampa disociación (HCD) nisqapa rakikuyninpaq. Muyu pachaqa 1 s nisqamanmi churasqa. Kay m/z valor kay fragmento péptido kaqmanta tupukurqa kay trampa de iones kaqpi kay aswan juch’uy AGC diana kaqwan 5×104 kaqwan chanta kay máximo inyección pachawan 86 ms kaqwan. Fragmentación nisqamantaqa, precursor nisqatam churarqaku lista de exclusión dinámica nisqapi 45 s. TMT nisqawan sutichasqa péptidos nisqakunam rakisqa karqa 50 cm, 75 μm Acclaim PepMap columnapi (Thermo Fisher Scientific, catálogo numero 164942), chaymantam espectros migración nisqakunata qawarirqaku espectrómetro de masas Orbitrap Lumos Tribrid (Thermo Fisher Scientific) nisqawan, chaymi equipasqa karqa equipo de iones de forma de onda asimétricas de alto campo (FAIMS) nisqawan (Thermo Fisher Scientific) llamkan iskay tensiones de compensación nisqapi −50 chaymanta −70 V. MS3 akllasqa sincronización precursor nisqapi hapipakuspa TMT willakuy ion señal tupunapaq llamk'achin. Chay péptido t’aqayqa ruwakurqa EASY-nLC 1200 nisqapi, 90% elución lineal gradiente nisqawan, 6%manta 31%kama tampón concentración nisqawan; tampón A 0,1% FA, tampón Btaq 0,1% FA, 80% ACN ima. Chay columna analítica nisqa 50°C nisqapi llamk’achisqa. FreeStyle (1.6 kaq laya, Thermo Fisher Scientific) kaqwan llamk'achiy, ñawpaq willañiqita FAIMS compensación voltaje kaqmanhina rakinapaq.
Proteína nisqa riqsichiy hinaspa yupay. Huñusqa Andromeda maskanapaq llamk'achispa, ñawpaq willakuykunaqa MaxQuant 1.5.2.8 (https://maxquant.org/) llamk'achispa t'aqwisqa karqan. Aswanta kay Cre recombinasa chanta kay YFP secuencias kaqmanta kay Aequorea victoria kaqmanta jap’isqa, kay espectros fragmentos péptidos kaqmanta mask’akurqa kay secuencia canónica kaqmanta chanta kay secuencia isoforma kaqmanta kay proteoma de referencia de rata kaqmanta (Proteoma ID UP000000589, UniProtmanta uraykachisqa kay mayo killapi 2017 watapi) . Oxidación de metionina chaymanta acetilación proteica N-terminal nisqa churasqa karqan modificaciones variables hina; cisteína carbamoil metilación nisqa churasqa karqan fija modificaciones hina. Chay parámetros de digestión nisqakunan churasqa kanku “especificidad” nisqaman hinallataq “tripsina/P” nisqaman. Kay aswan pisi yupay kay péptidos kaqmanta chanta kay péptidos de navajas kaqmanta kay proteína riqsichiypaq llamk’achisqankuqa 1; aswan pisi yupay sapalla péptidos kaqmanta 0. Kay condiciones kaqpi kay mapa péptidos tupachiypi, kay tasa de identificación proteica 0,01 karqa. “Iskay kaq Péptido” nisqa akllana atichisqa kachkan. “Ruwaypura tupachiy” akllanata llamk'achiy allin riqsichiykunata hukniray ñawpaq willañiqikunapura t'inkinapaq. LFQ yupay ratio mínimo 1 nisqawanmi mana etiquetayuq cuantificación (LFQ) nisqapaq (60). Chay LFQ kallpaqa filtrasqa kachkan iskay valores validos nisqallapas huk grupo genotipo nisqapipas sapa pachakunapi, chaymanta extrapolasqa huk distribución normal nisqamanta huk ancho de. 0.3 hinaspa urayman kuyuy 1.8. Perseus computadora plataforma (https://maxquant.net/perseus/) chaymanta R (https://r-project.org/) llamk'achiy LFQ ruwasqakunata t'aqwinapaq. Huk iskay ñanniyuq t prueba moderada kay limma software paquete kaqmanta llamk’achikurqa kay análisis de expresión diferencial kaqpaq ( 61 ). Análisis de datos exploratorio nisqa ruwakun ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally hinaspa pheatmap nisqawan. Chay TMT nisqapi ruwasqa proteómica nisqamanta willakuykunaqa MaxQuant 1.6.10.43 nisqawanmi qawarisqa karqa. Maskay crudo proteómica nisqamanta willakuykunata UniProtpa runa proteómica nisqamanta willakuypa waqaychananmanta, chaymi uraykachisqa karqa septiembre killapi 2018. Chay anlisispiqa kachkanmi factor de corrección isótopo nisqa ruwaqpa qusqan. R nisqapi limma nisqawanmi análisis de expresión diferencial nisqapaq. Ñawpaq willay, willaypa tiyapuynin maskana ruwaykuna, chaymanta willay t'aqwiy llamkana puriy chaymanta ruwasqakuna llapa waqaychasqa kanku ProteomeXchange alianza kaqpi PRIDE socio waqaychasqa kaqnintakama willay huñu riqsichiq PXD019690 kaqwan.
Anotaciones funcionales nisqakunam anlisis nisqataqa qhapaqyachin. Chay Análisis de Camino de Ingenio (QIAGEN) nisqa yanapakuywanmi 8 semanapi churasqa willakuypa términos de anotación funcional nisqapa qhapaq kayninta yachakurqa (1 kaq siqi). Pisi rimayllapi, chay lista cuantitativa proteica nisqa LC-MS/MS (espectrometría de masas tándem) nisqamanta análisis de datos nisqamanta hurqusqa, kay criterios de filtro nisqawanmi llamk’achisqa: Mus musculus nisqa akllasqa kachkan especie hinallataq fondo hina, chaymantam categoría nisqapiqa qawarikun chay valor P Benjamini nisqapa allichasqan enriquecimiento 0,05 utaq aswan pisi kananpaq, chaymi qawarisqa significativo nisqa. Kay grafico nisqapahqa sapa cluster nisqapi pichqa punta exceso categoría nisqakunam qawarichikun, chay valor P ajustado nisqapi hapipakuspa. Prueba t múltiple nisqawan, iskay etapa programa de impulso lineal nisqawan Benjamini, Krieger, Yekutieli (Q = 5%) nisqawan, análisis de expresión proteica de tiempo-curso nisqa ruwakun sapa categoría nisqapi riqsisqa importante candidatokunapi, sapa filataq sapanmanta t’aqwirikun. Manan necesariochu huk SD constante nisqa adoptanapaq.
Kay yachaypa ruwasqankunata tupachinapaqmi bases de datos publicadas nisqawan, chaynallataqmi 1 kaq siqipi Venn diagramata ruwanapaq, lista proteica cuantitativa nisqawan MitoCarta 2.0 anotacionkunawan hukllawakurqanchik ( 24 ). Chay siq'ita ruwanapaq internetpi llamk'achiy Venn siq'i siq'i (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) nisqawan.
Detallada willakuypaq kay procedimientos estadísticos llamk’achisqankumanta kay análisis proteómico kaqpaq, ama hina kaspa qhaway kay tupaq t’aqapi Materiales y Métodos kaqpi. Tukuy wakin experimentokunapaqqa, chayman hina leyendapim tarikunman detallada willakuykunata. Mana huk nisqa kaptinqa, llapan willakuykunaqa promedio ± SEM nisqapim qawarichikun, chaymantam llapallan anlisis estadísticos nisqakuna ruwakurqa software GraphPad Prism 8.1.2 nisqawan.
Kay qillqasqapaq yapasqa materialkunapaq, ama hina kaspa qhaway http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1
Kayqa huk kichasqa yaykuy qillqam, Creative Commons Atribución-Mana Comercial Licenciapa kamachiyninkunamanhina rakisqa, mayqinchus mayqin mediopipas llamk'achiyta, rakiyta chaymanta mirachiyta saqin, qhipa llamk'achiyta mana qhatuypaq gananciapaqchu chaymanta premisa ñawpaq llamk'ay chiqan kasqan. Willakuy.
Qhaway: Correo electrónico direccionniyki qunaykipaqlla mañaykiku chaymanta chay p'anqaman yuyaychasqayki runa yachanqa chay correo electrónico rikunankuta munasqaykita chaymanta mana spam kaqta. Manam ima correo electrónico direccionkunatapas hapisaqkuchu.
Kay tapuyqa watukuq kasqaykita pruebanapaq chaymanta kikillanmanta spam apachiyta hark'anapaq llamk'achkan.
E. Motori, I. Atanassov, S. M. V. Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson sutiyuq runa
Análisis proteómico kaqmanta kay neuronas disfuncionales kaqmanta rikuchirqa kay programas metabólicos activados kasqankuta kay neurodegeneración kaqmanta hark’anankupaq.
E. Motori, I. Atanassov, S. M. V. Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson sutiyuq runa
Análisis proteómico kaqmanta kay neuronas disfuncionales kaqmanta rikuchirqa kay programas metabólicos activados kasqankuta kay neurodegeneración kaqmanta hark’anankupaq.
©2020 Asociación Americana para el Avance de la Ciencia nisqa. tukuy hayñikuna waqaychasqa. AAAS nisqaqa HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef hinaspa COUNTER nisqakunapa yanapaqninmi. CienciaAvances ISSN 2375-2548 nisqapi.