Kay qillqasqaqa “Allichay resistencia de la legumbres a patógenos y plagas” nisqamanta, tukuy 5 qillqasqakunata qhaway
Kay agente causal kay hongos yura unquy necrosis kaqmanta kay Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary huk estrategia multi-nivel kaqwan kay hukniray huésped yurakunata infectananpaq. Kay yachayqa propone kay diamina L-ornitina kaqwan llamk’ayta, huk aminoácido mana proteico kaqwan mayqinchus huk aminoácidos esenciales kaqpa sintesisninta kallpachan, huk estrategia alternativa de gestión hina kay Phaseolus vulgaris L. kaqmanta kutichiykuna molecular, fisiológica chanta bioquímica kaqmanta kay yuraq moho kaqman kay Pseudomonas sclerotiorum kaqwan ruwasqa kaqta kallpachanapaq. Experimentos in vitro kaqpi rikuchirqanku kay L-ornitina anchata hark’arqa kay micelio wiñayninta kay S. pyrenoidosa kaqmanta huk dosismanta dependiente kaqpi. Chaymantapas, invernadero nisqapi yuraq moho nisqapa sinchi kaynintam anchata pisiyachinman. Chaymantapas, L-ornitinaqa hampisqa yurakunapa wiñaynintam kallpancharqa, chaymi qawarichin pruebasqa L-ornitinapa concentracionninkuna mana fitotóxicas kasqankuta hampisqa yurakunapaq. Chaymantapas, L-ornitinaqa antioxidantes mana enzimáticos (fenólicos solubles totales y flavonoides) chanta antioxidantes enzimáticos (catalasa (CAT), peroxidasa (POX), polifenol oxidasa (PPO) ima expresiónta kallpacharqa, chanta kimsa antioxidantewan tupaq genes (PvCAT1, PvSOD, PvGR) ima expresiónta yaparqa. Chaymantapas, análisis in silico nisqapim qawarikurqa huk putativa oxaloacetato acetilhidrolasa (SsOAH) nisqa proteína nisqapa kayninta S. sclerotiorum genoma nisqapi, chaymi anchata rikchakurqa oxaloacetato acetilhidrolasa (SsOAH) nisqa proteína nisqakunaman Aspergillus fijiensis (AfOAH) hinaspa Penicillium sp. (PlOAH) nisqawanmi anlisis funcional nisqamanta, dominios conservados nisqamanta, topología nisqamanta ima. Interesantem, L-ornitina yapayqa papa caldo de dextrosa (PDB) medio nisqamanmi anchata pisiyachirqa expresión de gen SsOAH nisqa S. sclerotiorum micelia nisqapi. Chaynallataqmi, L-ornitina nisqapa exógena nisqapa churakuyninqa anchata pisiyachirqa expresión de gen SsOAH nisqa micelios fúngicos nisqapi, hampisqa yurakunamanta huñusqapi. Tukuyninpiqa, L-ornitina churayqa anchatam pisiyachirqa ácido oxálico nisqapa secrecionninta iskaynin medio PDB nisqapi chaynallataq infectasqa raphikunapipas. Tukuchinapaq, L-ornitina huk ruwayta ruwan kay estado redox kaqta waqaychaypi chanta kay infectasqa yurakunap defensa kutichiyninta kallpachaypi. Kay yachaypa ruwakuyninqa yanapanmanmi musuq, pachamamawan allin ruwaykunata ruwaypi, yuraq mohota controlanapaq, chaynallataqmi habas ruruchiypi, huk tarpuykunapipas imayna kayninta pisiyachinapaq.
Yuraq moho, kay hongo necrotrófico Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary kaqwan ruwasqa, huk thuñichiq, rurukuna pisiyachiq unquymi, chaymi hatun peligrota churan pachantinpi habas (Phaseolus vulgaris L.) ruruchiyman (Bolton et al., 2006). Sclerotinia sclerotiorum nisqaqa hukninmi aswan sasa allpapi apasqa hongos nisqa yurakuna unquchiqkuna controlanapaq, hatun anfitrión nisqayuqmi 600 masnin yura especies nisqamanta chaynallataqmi usqaylla macerar tejidos huésped nisqa mana específico nisqapi (Liang y Rollins, 2018). Mana allin kaqtinqa, kawsayninpi huk fase critica nisqapi purin, unay pacha puñusqa qhipakuchkan yana, sinchi, muhuman rikch’akuq estructurakuna hina ‘esclerotia’ sutiyuq allpapi utaq yuraq, sumaq wiñaynin hina micelio utaq saphi saphipi infectasqa yurakunapi (Schwartz et al., 2005). S. sclerotiorumqa esclerotia nisqa ruwayta atin, chaymi infectasqa chakrakunapi unay pacha kawsananpaq, unquy pachapipas mana chinkananpaq (Schwartz et al., 2005). Esclerotios nisqakunaqa achka nutrientes nisqayuqmi, allpapiqa unay pacham takyanman, chaymantam inoculo primario hina kanman qatiqnin infecciones nisqapaq (Schwartz et al., 2005). Allin kaptinqa, esclerotios nisqakunam wiñan hinaspam wayrapi esporas nisqakunata paqarichimunku, chaykunam yurapa llapa allpapa hawanpi kaq partenkunata unquchinman, chaypim kanman ichaqa mana chayllachu, t’ikakunata, saphikunata utaq vainakunatapas (Schwartz et al., 2005).
Sclerotinia sclerotiorum huk achka patayuq estrategia llamk’achin kay huésped yurakunata infectananpaq, kaytaq huk serie coordinado eventos kaqwan ruwakun kay esclerotial germinación kaqmanta kay síntomas wiñayninkama. Qallariypiqa, S. sclerotiorumqa esporas suspendidas (ascosporas sutichasqa) nisqatam ruwan hongoman rikchakuq estructurakunamanta apothecia sutiyuq, chaykunam wayraman tikrakun hinaspam infectasqa yurakunapa runtukunapi mana kuyuchiq esclerotia nisqaman wiñan (Bolton et al., 2006). Chaymantaqa chay hongoqa ácido oxálico nisqatam lluqsichin, huk factor virulencia nisqa, yurakunapa celula pirqapi pH nisqa kamachinanpaq, degradación enzimática nisqatapas chaynallataq invasión tisular nisqatapas kallpanchananpaq (Hegedus y Rimmer, 2005), chaynallataqmi planta huésped nisqapa oxidativo nisqa ruphaynintapas harkan. Kay acidificación ruwayqa yura celula pirqata pisiyachin, allin pachata qun normal chanta eficiente llamk’ananpaq kay enzimas degradantes de pirqa celular hongo (CWDEs) kaqpaq, kay patógeno atipananpaq kay barrera física kaqmanta chanta kay tejidos huésped kaqman yaykunanpaq (Marciano et al., 1983). Huk kuti yaykusqa, S. sclerotiorum huk yupay CWDEs kaqta lluqsichin, kayhina poligalacturonasa chanta celulosa kaqwan, kaytaq kay infectasqa tejidos kaqpi mast’arikuyninta yanapan chanta kay necrosis tisular kaqta ruwan. Kay progresión kay lesiones kaqmanta chanta kay esteras hifales kaqmanta apamun kay síntomas características kay yuraq moho kaqmanta (Hegedus chanta Rimmer, 2005). Chaykama, kay huésped yurakunaqa riqsinku kay patrones moleculares asociados a patógenos (PAMPs) kaqninta kay patrones riqsiy receptores (PRRs) kaqnintakama, kaytaq huk serie señalización ruwaykunata qallarichin kaytaq qhipaman kay defensa kutichiykunata activan.
Chunka watakunaña unquykunata controlanankupaq kallpachakuptinkupas, pisiyapunmi allin resistente germoplasma nisqa habas nisqapi, huk qhatuy tarpuykunapi hina, chay patógeno nisqapa resistencianrayku, kawsasqanrayku, adaptabilidad nisqarayku ima. Chayraykum unquykuna kamachiyqa ancha sasachakuyniyuq, chaymi huk estrategia integrada, multifacética nisqa necesitakun, chaypim kachkan huk combinación de prácticas culturales, control biológico, fungicidas químicos nisqakuna (O’Sullivan et al., 2021). Control químico kay yuraq moho kaqmanta aswan allin imaraykuchus kay fungicidas, allinta chanta allin pachapi churasqa kaqtinqa, allinta controlanman kay unquy mast’arikuyninta, pisiyachinman kay infección sinchi kayninta, chanta kay rendimiento chinkachiyta pisiyachinman. Ichaqa, fungicidas nisqapi llumpay llamkachiypas, llumpay hapipakuypas, S. sclerotiorum nisqapa cepas resistentes nisqapa rikurimuyninmanmi apakunman, chaynallataqmi mana allintachu afectanman mana objetivo nisqa organismokunata, allpapa qhali kayninta, yakupa allin kaynintapas (Le Cointe et al., 2016; Ceresini et al., 2024). Chayraykum pachamamawan allin ruwaykunata tariyqa aswan allinman tukupun.
Poliaminas (PAs), putrescina, espermidina, espermina, cadaverina ima, allpapi yurakuna unquchikuqkunapa contranpi prometedor alternativa hina kanman, chaywanmi llapanpi utaq wakinpi pisiyachinman peligroso fungicidas químicos nisqapa llamkayninta (Nehela et al., 2024; Yi et al., 2024). Aswan hatun yurakunapiqa, PAs nisqakunaqa achka procesos fisiológicos nisqapim llamkanku, chaypim kachkanku, ichaqa mana chayllachu, celulakuna rakinakuypi, diferenciación nisqapi, chaynallataq estrés abióticos y bióticos nisqaman kutichiypas (Killiny y Nehela, 2020). Paykunaqa antioxidantes hina ruwayta atinku, yanapankuman especies de oxígeno reactivo (ROS) nisqakunata q’uñichiyta, homeostasis redox nisqa waqaychayta (Nehela y Killiny, 2023), defensawan tupaq genes nisqakunata induciyta atinku (Romero et al., 2018), imaymana metabólico ñankunata kamachinkuman (Nehela hinallataq Killiny, 2023), fitohormonas endógenas nisqakunata modulankuman (Nehela y Killiny, 2023 2019), resistencia adquirida sistémica (SAR) nisqa churanku, chaymanta planta-patógeno nisqa interacciones nisqakunata kamachinku (Nehela y Killiny, 2020; Asija et al., 2022; Czerwoniec, 2022). Chaynapim qawarina, chay mecanismos específicos nisqapas, chay PAkunapa ruwayninkunapas yurakunapa amachayninpiqa hukniraymi, yurakunapa especienman hina, patógenos nisqaman hina, chaynallataq pachamamapa imayna kayninman hina. Yurakunapi aswan achka PA nisqa biosintetizasqa poliamina L-ornitina esencial nisqamanta (Killiny y Nehela, 2020).
L-ornitinaqa achka ruwaykunata ruwan yurakuna wiñayninpi, wiñayninpipas. Ejemplopaq, ñawpaq yachaykunaqa qawarichikunmi arrozpi (Oryza sativa), ornitinaqa nitrógeno reciclajewan (Liu et al., 2018), arrozpa ruruyninwan, calidadwan hinaspa aromawan (Lu et al., 2020), chaynallataq yakupa estrés nisqawan kutichiywan (Yang et al., 2000) tupachisqa kanman. Chaymantapas, L-ornitinapa exógena nisqa churakuyninqa anchatam kallpancharqa ch’akiyman toleranciata remolacha azúcar (Beta vulgaris) nisqapi (Hussein et al., 2019) chaynallataqmi cebolla (Allium Cepa) (Çavuşoǧlu y Çavuşoǧlu, 2021) hinaspa anacardo (Anacardium occidentale) nisqapipas kachipa estrés nisqatapas pisiyachirqa. yurakuna (da Rocha y al., 2012). Kay L-ornitinapa ruwaynin atiyqa kay estrés abiótico hark’aypi kanman kay involucramiento kay prolina huñukuyninpi kay hampisqa yurakunapi. Ejemplopaq, kay metabolismo prolina kaqwan tupaq genes, kayhina ornitina delta aminotransferasa (delta-OAT) chanta prolina deshidrogenasa (ProDH1 chanta ProDH2) genes kaqwan, ñawpaqta willasqa kanku kay Nicotiana benthamiana chanta Arabidopsis thaliana kaqwan defiendekuypi mana anfitrión kaq Pseudomonas syringae cepas (Senthil-Kumar chanta Misore llaqtapi, 2012 watapi). Hukninpiqa, hongos ornitina decarboxilasa (ODC) nisqa necesitakun patógeno wiñananpaq (Singh et al., 2020). Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici via silenciamiento genético inducido por huésped (HIGS) nisqawanmi tomate yurakunapa Fusarium ch’akiyman harkakuyninta anchata kallpancharqa (Singh et al., 2020). Ichaqa, mana allintachu yachakun kay ruway atiy kay ornitina exógena churaymanta kay estrés bióticos kaqmanta kay fitopatógenos kaqhina. Aswan allinqa, kay ornitina kaqpa efectosnin kay unquyman hark’akuypi chanta kay asociados fenómenos bioquímicos chanta fisiológicos kaqpi aswanta mana mask’asqa kanku.
Entendimiento kay complejidad kay infección S. sclerotiorum kaqmanta kay legumbres kaqmantaqa ancha allinmi kay estrategias de control efectivas ruwanapaq. Kay yachaypiqa, diamina L-ornitina nisqapa ruwaynin atiyniyuq kaynintam riqsiyta munarqaniku, chaymi huk factor clave hina, chaynapi legumbre yurakunapa Sclerotinia sclerotiorum infección nisqaman harkakuyninpa mecanismos de defensa nisqa kallpanchanapaq. Hipótesis ruwayku, aswanta kallpachaymanta defensa kutichiykunata infectasqa yurakunamanta, L-ornitinapas huk ruway clave ruwan kay redox estadota waqaychaypi. Proponeyku kay efectos potenciales kay L-ornitina kaqmanta kay regulación kaqwan kay mecanismos de defensa antioxidante enzimático kaqwan chanta mana enzimático kaqwan chanta kay interferencia kaqwan kay factores patogenicidad/virulencia hongo kaqwan chanta kay proteínas asociadas kaqwan ima. Kay iskay ruwayniyuq kay L-ornitina kaqmanta ruwan huk prometedor candidato huk estrategia sostenible kaqpaq kay yuraq mohopa impactonta mitigananpaq chaymanta kay resistencia comun legumbre tarpuykunamanta kay kallpasapa patógeno hongo kaqman kallpachananpaq. Kay yachaypa ruwakuyninqa yanapanmanmi musuq, pachamamawan allin ruwaykunata ruwaypi, yuraq mohota controlanapaq, chaynallataqmi legumbre ruruchiypi imayna kayninta pisiyachinapaq.
Kay yachaypiqa, material experimental hinam churakurqa huk variedad comercial susceptible de habas comunes, Giza 3 (Phaseolus vulgaris L. cv. Giza 3). Saludable muhukunataqa sumaq sunquwanmi qurqaku Departamento de Investigación de Legumbres, Instituto de Investigación de Cultivos de Campo (FCRI), Centro de Investigación Agrícola (ARC), Egipto. Pichqa muhukunatam tarpurqaku plástico mankakunapi (ukhu diámetro 35 cm, ukunpi 50 cm) S. sclerotiorumwan infectasqa allpawan huntasqa invernadero nisqapi (25 ± 2 °C, humedad relativa 75 ± 1%, 8 h k’anchay/16 h tutayaq). Tarpuymanta 7–10 punchaw (DPS) nisqapiqa, mallkikunataqa llañuyachirqakum, sapa mankapi iskay mallkikunalla huk rikchaq wiñayniyuq, kimsa huntasqa mastarisqa raphikuna saqinanpaq. Llapan mankapi yurakunatam sapa iskay semanapi huk kutita qarparqaku, sapa killam abonorqaku chay qusqa variedad nisqapaq ritmo recomendasqaman hina.
500 mg/L L-ornithinediamina (ácido (+)-(S)-2,5-diaminopentanoico; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Alemania) nisqatapas, ñawpaqtaqa 50 mg nisqatam 100 mL destilada estéril yakupi chulluchirqaku. Chaymantaqa chay solución de stock nisqatam diluirqunku hinaspam qatiqnin experimentokunapi servichikurqaku. Pisi rimayllapi, suqta serie concentraciones de L-ornitina (12,5, 25, 50, 75, 100, chanta 125 mg/L) pruebasqa karqa in vitro kaqpi. Chaymantapas, yaku destilada estéril nisqatam control negativo (Mock) hina churarqaku, chaymantam control positivo hina fungicida comercial “Rizolex-T” 50% polvo humectable (toclofos-metil 20% + tiram 30%; KZ-Kafr El Zayat Pesticides and Chemicals Company, Kafr El Zayat, Gharbia Governorate, Egipto) nisqawan. Fungicida comercial “Rizolex-T” nisqatam pruebarqaku in vitro nisqapi pichqa concentraciones nisqapi (2, 4, 6, 8 y 10 mg/L).
Muestras de habas comunes tallos nisqamanta chaymanta vainas nisqamanta rikuchiq síntomas típicos de moho yuraqmanta (tasa de infestación: 10–30%) huñusqa karqa comercial chakrakunamanta. Yaqa llapan infectasqa yurakunapa materialninkuna especie/variedad nisqawan riqsisqa kaptinpas (variedad comercial susceptible Giza 3), wakinqa, aswantaqa llaqta qhatukunamanta hurqusqa, mana riqsisqa especie nisqakunam. Chay huñusqa infectasqa materialkunatam ñawpaqtaqa hawamanta desinfectarqaku 0,5% hipoclorito sódico soluciónwan 3 minuto, chaymantam achka kutita mayllarqaku yaku destilada estérilwan hinaspam ch’akichirqaku papel filtro estérilwan, chaynapi llumpay yakuta hurqunankupaq. Chaymantaqa chay infectasqa órganos nisqakunataqa huch’uy t’aqakunapin kuchurqanku chawpi tejidomanta (qhali tejidos nisqawan infectasqa tejidos nisqakuna ukhupi), papa dextrosa agar (PDA) nisqa medio nisqapi uywarqanku, chaymantataq 25 ± 2 °C nisqapi 12 h k’anchay/12 h tutayaq ciclo nisqawan 5 p’unchay incubarku, esclerotia nisqa paqarimuyninta kallpachananpaq. Chaynallataqmi chay método punta micelial nisqawanqa chuyanchakurqa aislados de hongos nisqakunata culturas mixtas utaq contaminadas nisqamanta. Chay chuyanchasqa hongo aislado nisqa ñawpaqtaqa riqsichikurqa características morfológicas culturales nisqaman hina, chaymantataqmi S. sclerotiorum kasqanmanta takyachisqa karqa microscópico nisqaman hina. Tukuyninpiqa, tukuy chuyanchasqa aislados nisqakunam pruebasqa karqa patogenicidad nisqamanta chay susceptible cultivar de habas comunes Giza 3 nisqapi, Kochpa postulados nisqawan tupananpaq.
Chaymantapas, aswan invasivo S. sclerotiorum aislado (aislado #3) aswanta takyachisqa karqa secuenciación espaciador transcrito interno (ITS) nisqapi White et al., 1990 nisqapa willakusqanman hina; Baturo-Ciesniewska et al., 2017. Pisi rimayllapi, aislados nisqakunatam papa dextrosa caldo (PDB) nisqapi uywarqaku hinaspam 25 ± 2 °C nisqapi 5–7 punchawta incubarqunku. Chaymantaqa micelio hongo nisqa huñusqa, queso tela nisqawan filtrasqa, iskay kutita mayllasqa estéril yakuwan, chaymantataq ch’akichisqa filtro papel estéril nisqawan. ADN genómico nisqatam sapaqcharqaku Quick-DNATM Fungal/Bacterial Miniprep Kit nisqawan (Kuramae-Izioka, 1997; Atallah et al., 2022, 2024). Chaymanta kay ITS rDNA suyuqa amplificasqa karqa kay específico paris de cebadores ITS1/ITS4 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG TCCTCCGCTTATTGATATGC; suyasqa sayay: 540 bp) ( Baturo-Ciesniewska et al., 2017 ). Chay chuyanchasqa PCR rurukunam secuenciacionpaq apachisqa karqa (Beijing Aoke Dingheng Biotechnology Co., Ltd.). Chay ITS rDNA secuencias nisqakunam iskay ñanpi secuenciasqa karqa Sanger secuenciación nisqa ruwaywan. Chaymantaqa chay huñusqa tapukuy secuenciakunam tupachisqa karqa GenBank nisqapi chaynallataq Centro Nacional de Información Biotecnología nisqapi (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) nisqapipas, BLASTn software nisqawan. Chay tapukuy secuenciaqa tupachisqa karqa 20 huk S. sclerotiorum cepas/aislados nisqakunawan, chaykunatam hurqurqaku chay qipa willakuykunamanta NCBI GenBank nisqapi (Tabla Suplementaria S1) ClustalW nisqawan Paquete de Análisis de Genética Evolutiva Molecular nisqapi (MEGA-11; versión 11) (Kumar et al., 2024). Análisis evolutivo nisqa ruwakurqa método de máxima probabilidad nisqawan chaymanta modelo general de sustitución nucleótido reversible nisqawan (Nei y Kumar, 2000). Aswan hatun tronco-probabilidad nisqayuq sacham qawachikun. Chay qallariy sachaqa heurística maskanapaqmi akllasqa, aswan hatun log-probabilidad nisqayuq sacha akllaspa, vecino-joining (NJ) sachawan (Kumar et al., 2024) chaymanta máxima parsimonia (MP) sachawan. NJ sachaqa ruwakurqa matriz de distancia paris nisqawan yupasqa modelo general tiempo-reversible nisqawan (Nei y Kumar, 2000).
L-ornitinapa, bactericida “Rizolex-T” nisqapa actividad antibacteriana nisqapas in vitro nisqapim tarikurqa chay método de difusión agar nisqawan. Método: L-ornitinapa (500 mg/L) solución stock nisqamanta allinta hapispa 10 ml medio nutriente PDA nisqawan allinta chaqruspa solucionkunata wakichina, 12,5, 25, 50, 75, 100, 125 mg/L nisqa concentraciones finales nisqawan. Pichqa concentraciones de fungicida “Rizolex-T” (2, 4, 6, 8 y 10 mg/L) chaymanta yaku destilada estéril nisqawanmi control hina churakurqa. Chay medio solidificasqaña kaptin, chayraq wakichisqa tapón micelial Sclerotinia sclerotiorum culturamanta, 4 mm diámetroyuq, Petri platopa chawpinman apasqa karqa, chaymanta 25±2°C nisqapi uywasqa karqa, micelio tukuy control Petri platota tapanankama, chaymantaqa hongo wiñayninmi registrasqa karqa. S. sclerotiorumpa radial wiñayninpa pachakmanta huknin harkakuyninta yupay ecuación 1 nisqawan:
Chay experimentoqa iskay kutitam ruwakurqa, sapa grupo control/experimental nisqapaqmi suqta replicados biológicos nisqawan, sapa replicado biológico nisqapaqñataqmi pichqa mankakuna (iskay planta sapa mankapi). Sapa replicado biológico nisqatam iskay kutita analizarqaku (iskay replicados técnicos) chaynapi chay experimental nisqapa ruwakuyninpa exactitud, confiabilidad hinaspa reproducibilidad nisqa kananpaq. Chaymantapas, análisis de regresión de probit nisqawanmi yupasqa karqan chay concentración inhibidora kuskan máxima (IC50) hinallataq IC99 (Prentice, 1976).
L-ornitinapa atiyninta invernadero nisqapi chaninchanapaqmi, iskay qatiqninpi experimentokuna mankapi ruwakurqa. Pisi rimayllapi, mankakunata huntachirqaku esterilizado t’uru-rit’i allpawan (3:1) hinaspam inocularqaku chayraq preparasqa cultura de S. sclerotiorumwan. Ñawpaqtaqa, aswan invasivo aislado S. sclerotiorum (aislado #3) nisqatam cultivarqaku huk esclerociota kuskanman kuchuspa, uyanta urayman churaspa PDA nisqapi hinaspa 25°C nisqapi sapa kuti tutayaqpi (24 h) 4 punchaw incubasqata, chaynapi micelio wiñayta kallpanchanapaq. Chaymantaqa tawa tapones de agar 5 mm diámetros nisqakunatam hurqurqaku punta kaq kantumanta hinaspam inocularqaku 100 g trigowan arroz salvadowan chaqrusqa estérilwan (1:1, v/v) hinaspam llapa matrazkunata 25 ± 2 °C nisqapi 5 punchaw incubarqunku 12 h k’anchay/12 h tutayaq ciclopi esclerotia nisqapa formación nisqa kallpanchanapaq. Llapan matrazpa kaqninkunatam allinta chaqrurqaku, chaynapi homogeneidad kananpaq manaraq allpata yapachkaspa. Chaymantaqa, sapa mankamanmi 100 g salvado colonizador mezclata yapaykurqaku, chaynapi patógenos nisqakuna sapa kutilla kananpaq. Chay inoculasqa mankakunatam qarparqaku hongokuna wiñananpaq, hinaspam 7 punchaw invernadero nisqapi churarqaku.
Chaymantataq sapa mankapi Giza 3 variedad nisqamanta pichqa muhukunata tarpurqaku. L-ornitinawan, fungicida Rizolex-Twan hampisqa mankakunapaqqa, ñawpaqtaqa iskay horatam esterilizado muhukunataqa iskay compuestokunapa yakuyuq solucionninpi chulluchirqaku, IC99pa tukukuyninpi yaqa 250 mg/L hinaspa 50 mg/L, chaymantam huk hora wayrawan chakichirqaku manaraq tarpuchkaspa. Hukninpiqa, muhukunatam yaku destilada estéril nisqapi chulluchirqaku control negativo hina. 10 p’unchawmanta, manaraq ñawpaq qarpachkaspa, mallkikunata llañuyachispa, sapa mankapi iskay sumaq mallkikunallata saqispa. Chaymantapas, S. sclerotiorumwan infección kananpaqmi, habas yurakunapa sapinkunata kikin wiñayninpi (10 punchaw) iskay chikan sitiokunapi kuchurqaku bisturí esterilizada nisqawan hinaspam sapa k’iriman churarqaku yaqa 0,5 g salvado colonizador nisqa chaqrusqata, chaymantam hatun humedad nisqawan infección nisqawan unquy wiñachiyta kallpancharqaku llapa inculado nisqa yurakunapi. Plantas controles nisqapas chaynallataqmi k’irisqa karqaku, chaynallataqmi huk kaqlla (0,5 g) mezcla de salvado estéril, mana colonizado nisqa heridaman churasqa karqa hinaspam hatun humedadpi waqaychasqa karqa, chaynapi pachamama simulasqa kananpaq, chaynapi unquy wiñananpaq, chaynallataq hampi qutukunapurapi hukllawasqa kananpaq.
Método de tratamiento: Habas mallkikunatam qarparqaku 500 ml yakuyuq L-ornitina (250 mg/l) utaq fungicida Rizolex-T (50 mg/l) nisqawan allpata qarpaspa, chaymantam kimsa kutita yapamanta hampirqaku 10 punchawmanta. Chay controles tratados placebo nisqawanmi qarparqaku 500 ml yaku destilada estéril nisqawan. Llapan hampiykunam ruwakurqa invernadero nisqapi (25 ± 2°C, 75 ± 1% humedad relativa, chaymanta fotoperiodo 8 h k’anchay/16 h tutayaq). Llapan mankakunatam iskay killamanta qarparqaku hinaspam sapa killa hampirqaku abono NPK equilibradowan (20-20-20, 3,6% azufrewan hinaspa microelementos TEwan; Zain Seeds, Egipto) 3–4 g/l concentracionpi rociado foliarwan chay variedad específica nisqapa recomendacionninman hina chaynallataq fabricantepa kamachikuyninman hina. Mana huk nisqa kaptinqa, sapa replicado biológico nisqamanta huñusqa karqan puqusqa raphikuna hunt’asqa mast’arisqa (2 kaq, 3 kaq raphikuna patamanta) 72 h post-tratamiento (hpt) nisqapi, homogeneizasqa, huñusqa hinaspa waqaychasqa -80 °C nisqapi aswan análisis ruwanapaq, ichaqa mana limitasqachu, localización histoquímica in situquímica nisqamanta indicadores de estrés oxidativo nisqamanta, peroxidación lípida nisqamanta, enzimática nisqamanta hinallataq mana enzimática nisqamanta antioxidantes nisqakuna hinallataq expresión génica nisqakuna.
Yuraq moho infección kallpaqa sapa semana 21 p’unchawkuna inoculación kaqmanta (dpi) chaninchakurqa huk escala 1–9 kaqwan (Tabla Suplementaria S2) kay escala Petzoldt chanta Dickson kaqwan (1996) kay Teran et al. (2006) nisqapi. Pisi rimayllapi, habas yurakunapa sapinkunata, kallmankunatapas qawarirqakum inoculación nisqamanta qallarispa, chaynapi lesiones nisqakuna internodos nisqapi, ganglios nisqapi ima progresionninta qatipanankupaq. Chaymanta tupukurqa kay lesión karu kay punto de inoculación kaqmanta kay aswan karu puntokama kay tallo utaq rama kaqpi chaymanta huk puntuación 1–9 kaqmanta qusqa karqa maypichus kay lesión kasqanmanjina, maypichus (1) rikuchirqa mana rikukuq infección kaqta kay punto de inoculación qayllapi chanta (2–9) rikuchirqa huk pisi pisimanta yapakuyninta kay lesión tamaño kaqpi chanta kay progresión kaqpi kay nodos/internodos kaqpi (Tabla suplementario S2). Chaymantaqa yuraq moho infección intensidadta tikrakurqa pachakmanta hukninman kay fórmula 2 kaqwan:
Chaymantapas, chay área bajo de la curva de progresión de la enfermedad (AUDPC) nisqa yupasqa karqan kay fórmula nisqawan (Shaner y Finney, 1977), chaymi chayllaraq adaptasqa karqan yuraq ismunanpaq haba común nisqapaq (Chauhan et al., 2020) ecuación 3 nisqawan:
Maypichus Yi = unquypa sinchi kaynin ti pachapi, Yi+1 = unquypa sinchi kaynin qatiqnin kutipi ti+1, ti = ñawpaq tupuy pacha (p’unchawkunapi), ti+1 = qatiq tupuy pacha (p’unchawkunapi), n = llapan pacha puntokuna utaq qhaway puntokuna. Parámetros de crecimiento de habas nisqa yurakunapa sayaynin (cm), hayka kallmakuna sapa yurapi, hayka raphikuna sapa yurapi ima, sapa semana 21 punchawmi llapa replicados biológicos nisqapi registrasqa karqa.
Sapa replicado biológico nisqapiqa, raphi muestrakuna (iskay kaq, kimsa kaq hunt’asqa wiñasqa raphikuna patamanta) huñusqa karqan 45 p’unchay hampiymanta (15 p’unchay qhepa hampiymanta). Sapa replicado biológico nisqa pichqa mankayuqmi karqa (iskay yura sapa mankapi). Yaqa 500 mg ñut’usqa aychamantam fotosintético pigmentokuna hurqunapaq (clorofila a, clorofila b y carotenoides) 80% acetonawan 4 °C tutayaqpi. 24 hmantaqa, muestrakunatam centrifugarqurqaku, chaymantam chay hawa yakuta huñururqaku clorofila a, clorofila b hinaspa carotenoides nisqakuna colorimétrica nisqapi espectrofotómetro UV-160A (Shimadzu Corporation, Japón) nisqawan (Lichtenthaler, 1987) nisqapa ruwayninman hina, kimsa chikan longitudes de onda nisqapi absorbancia nisqa tupuspa (A470, A646 y A663 nm) nisqa. Tukuyninpiqa, kay contenido de pigmentos fotosintéticos nisqa yupasqa karqa kay fórmulas 4–6 nisqawan, chaytam Lichtenthaler (1987) willarqa.
72 h tratamiento qhipaman (hpt), raphikunata (iskay kaq, kimsa kaq hunt’asqa wiñasqa raphikuna patamanta) huñusqa karqa sapa replicado biológico nisqamanta, localización histoquímica in situ nisqapaq peróxido de hidrógeno (H2O2) chanta anión superóxido (O2•−) nisqapaq. Sapa replicado biológico nisqa pichqa mankayuqmi karqa (iskay yura sapa mankapi). Sapa replicado biológico nisqatam iskay kutipi (iskay replicados técnicos) analizarqaku, chaynapi chay métodopa exactitud, confiabilidad hinaspa reproducibilidad nisqa kananpaq. H2O2 chaymanta O2•− nisqakunam tarikurqa 0,1% 3,3′-diaminobenzidina (DAB; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Alemania) utaq nitroazul tetrazolio (NBT; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Alemania) nisqawan, chayman hina, Romero-Puertas et al. (2004) y Adam et al. (1989) pisi tikraykunawan. Localización histoquímica de H2O2 in situ nisqapaqmi, folletokunata infiltrado vacío nisqapi 0,1% DAB nisqawan 10 mM tampón Tris nisqapi (pH 7,8) chaymantataq incubasqaku temperatura ambiente nisqapi k’anchaypi 60 min. Raphikunataqa 0,15% (v/v) TCA nisqapi 4:1 (v/v) etanol:cloroformo nisqapi (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, El Cairo, Egipto) blanquearqanku, chaymantataq k’anchayman churarqanku tutayanankama. Chaynallataqmi, válvulas nisqakuna infiltrasqa vacío nisqapi 10 mM tampón fosfato potásico nisqawan (pH 7,8) 0,1 p/v % HBT nisqawan localización histoquímica nisqapaq O2•− in situ nisqapaq. Chay folletokunataqa 20 min temperatura ambiente nisqapi k’anchaypi incubarqunku, chaymantataqmi hanaqpi hina blanquearqaku, chaymantam kancharichirqaku yana azul/violeta manchakuna rikurimunankama. Chay ruwasqa marrón (H2O2 rikuchiq hina) utaq azul-violeta (O2•− rikuchiq hina) llimp’ipa kallpanmi chaninchasqa karqan Fiyi versión nisqawan siq’i ruway paquete ImageJ (http://fiji.sc; 7 p’unchay marzo killapi 2024 watapi qhawasqa).
Malondialdehído (MDA; huk marcador de peroxidación lípida hina) nisqatam tarirqaku Duwan Bramlagepa (1992) ruwasqankuman hina pisilla modificacionkunawan. Sapa replicado biológico nisqamanta raphikuna (iskay kaq, kimsa kaq hunt’asqa wiñasqa raphikuna patamanta) huñusqa karqan 72 h tratamiento qhepaman (hpt). Sapa replicado biológico nisqapiqa pichqa mankakunam karqa (iskay yura sapa mankapi). Sapa replicado biológico nisqatam iskay kutipi (iskay replicados técnicos) analizarqaku, chaynapi chay métodopa exactitud, confiabilidad hinaspa reproducibilidad nisqa kananpaq. Pisi rimayllapi, 0,5 g allpa raphi aychata MDA hurqunapaqmi 20% ácido tricloroacético (TCA; MilliporeSigma, Burlington, MA, EE.UU.) nisqawan, 0,01% hidroxitolueno butilado (BHT; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE.UU.) nisqawan. Chaymantaqa chay sobrenadante nisqapi MDA nisqa contenido nisqatam colorimétrica nisqapi tarirqaku, chay absorbancia nisqa tupuspa 532 y 600 nm nisqapi espectrofotómetro UV-160A nisqawan (Shimadzu Corporation, Japón) chaymantam expresasqa karqa nmol g−1 FW nisqawan.
Antioxidantes mana enzimáticos y enzimáticos nisqa chaninchanapaqmi, raphikunata (iskay kaq, kimsa kaq hunt’asqa wiñasqa raphikuna patamanta) huñusqa karqan sapa replicado biológico nisqamanta 72 h tratamiento qhepaman (hpt). Sapa replicado biológico nisqa pichqa mankayuqmi karqa (iskay yura sapa mankapi). Sapa muestra biológica nisqatam iskay kutipi (iskay muestra técnica) analizarqaku. Iskay raphikunatam nitrógeno líquido nisqawan ñut’urqanku, chaymantataqmi chiqanmanta antioxidantes enzimáticos y no enzimáticos nisqakunata, aminoácidos totales nisqakunata, contenido de prolina nisqakunata, expresión génica nisqakunata, cuantificación de oxalato nisqakunatapas tarirqaku.
Total soluble fenólicos nisqakunam determinasqa karqa reactivo Folin-Ciocalteu (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) nisqawan, pisilla modificaciones nisqawan chay método nisqamanta, chaytam willakurqaku Kahkonen et al. (1999) nisqa. Pisi rimayllapi, yaqa 0,1 g raphi tejido homogeneizado nisqatam hurqurqaku 20 ml 80% metanolwan tutayaypi 24 h hinaspam chay hawa yakuta huñurqaku centrifugacionmanta. 0,1 ml extracto de muestra nisqatam 0,5 ml reactivo Folin-Ciocalteu (10%) nisqawan chaqruspa 30 s kuyuchispa tutayaypi saqirqaku 5 min. Chaymantaqa sapa tubomanmi yapaykurqaku 0,5 ml 20% carbonato de sodio solución (Na2CO3; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies Company, El Cairo, Egipto) nisqawan, allinta chaqruspa, temperatura ambiente nisqapi tutayaqpi 1 h incubarqunku. Incubacionmantaqa, chay mezcla de reacción nisqapa absorbancianmi tupusqa karqa 765 nm nisqapi espectrofotómetro UV-160A nisqawan (Shimadzu Corporation, Japón). Chay concentración de fenoles solubles totales nisqa chay extractos de muestra nisqapiqa, curva de calibración de ácido gálico nisqawanmi (Fisher Scientific, Hampton, NH, EE.UU.) tarikurqa, chaymantam expresasqa miligramos de ácido gálico equivalente sapa gramo musuq llasayninpi (mg GAE g-1 musuq llasaynin).
Contenido total de flavonoides solubles nisqakunam tarikurqa Djeridane et al. (2006) pisilla tikraykunawan. Pisi rimayllapi, 0,3 ml chay hawapi metanol hurqusqamanta 0,3 ml 5% cloruro de aluminio solucionwan (AlCl3; Fisher Scientific, Hampton, NH, USA) chaqrusqa, kallpawan kuyurichisqa, chaymantam 5 min temperatura ambiente nisqapi incubasqa, chaymantam 0,3 ml 10% acetato de potasio solucionwan (Al-Gomhoria) yapasqa Farmacéutica y Suministros Médicos, El Cairo, Egipto), allinta chaqrusqa hinaspa temperatura ambiente nisqapi 30 min tutayaqpi incubasqa. Incubacionmantaqa, chay mezcla de reacción nisqapa absorbancianmi tupusqa karqa 430 nm nisqapi espectrofotómetro UV-160A nisqawan (Shimadzu Corporation, Japón). Chay concentración de flavonoides totales solubles nisqa extractos de muestra nisqapiqa, curva de calibración de rutina nisqawanmi (TCI America, Portland, OR, USA) tarikurqa, chaymantam expresasqa miligramos de rutina equivalente sapa gramo musuq llasayninpi (mg RE g-1 musuq llasaynin).
Chay tukuyninpi libre aminoácidos nisqa habas raphikunapiqa, reactivo ninhidrina modificado nisqawanmi (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) Yokoyamawan Hiramatsuwan (2003) yuyaykusqankuman hina, Sun et al. (2006) nisqapi. Pisi rimayllapi, 0,1 g allpamanta tejidota hurqurqaku tampón pH 5,4 nisqawan, chaymantam 200 μL hawa yakumanta 200 μL ninhidrina (2%) hinaspa 200 μL piridina (10%; Spectrum Chemical, New Brunswick, NJ, USA) nisqawan reaccionarqaku, chaymantam timpusqa yaku bañopi 30 min incubasqa, chaymanta chiriyachispa tupusqa 580 nm nisqapi espectrofotómetro UV-160A nisqawan (Shimadzu Corporation, Japón). Hukninpiqa, prolinaqa Batespa ruwayninwanmi tarikurqa (Bates et al., 1973). Prolina nisqatam hurqurqaku 3% ácido sulfosalicílico nisqawan (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) hinaspam centrifugacionta ruwaruspanku, 0,5 ml sobrenadante nisqatam 1 ml ácido acético glacialwan (Fisher Scientific, Hampton, NH, USA) hinaspa reactivo ninhidrina nisqawan chaqrurqaku, 90°C nisqapi 45 min incubarqunku, chiriyachispa tupurqaku 520 nm nisqapi kikin espectrofotómetro nisqawan, hawapi hina. Total aminoácidos libres nisqapas, prolina nisqapas chay raphi hurqusqakunapim tarikurqa curvas de calibración de glicinawan prolinawan (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EE.UU.) nisqawan, chaymantam expresasqa karqa mg/g musuq llasayninpi.
Antioxidante enzimas nisqapa actividad enzimática nisqa yachanapahqa, yaqa 500 mg homogeneizado tejido nisqatam hurqurqaku 3 ml tampón Tris 50 mM (pH 7,8) nisqawan, chaypim 1 mM EDTA-Na2 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) hinaspa 7,5% polivinilpirrolidona (PVP; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), centrifugado 10.000 × g 20 min refrigeración (4 °C), chaymanta chay sobrenadante (extracto enzima crudo) huñusqa (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Chaymantaqa catalasa (CAT) nisqatam 2 ml tampón fosfato sódico 0,1 M (pH 6,5; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) nisqawan, 100 μl solucionwan 269 mM H2O2 nisqawan ima, Aebipa (1984) ruwayninman hina, actividad enzimática nisqa kayninta riqsinankupaq, pisilla modificacionkunawan (El-Nagar et al., 2023; Osman hukkunapas, 2023). Guaiacolmanta dependiente peroxidasa (POX) actividad enzimática nisqa tarikurqa Harrach et al. (2009) nisqapi. (2008) pisi modificacioneswan (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023) chaymanta actividad enzimática polifenol oxidasa (PPO) kaqmanta tarikurqa 2,2 ml tampón fosfato sódico 100 mM (pH 6,0), 100 μl guaiacol (químicos TCI, Portland, OR, USA) nisqawan 100 μl 12 mM H2O2 nisqawan. Chay ruwayqa pisillatam tikrasqa karqa (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Chay ensayo ruwakurqa reacción ruwasqamanta 3 ml solución de catecol (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) (0,01 M) musuq wakichisqa 0,1 M tampón fosfato (pH 6,0) nisqapi. CAT ruwayninqa tupukurqa H2O2pa descomposiciónninta qawarispa 240 nm (A240), POX ruwayninqa tupusqam qawarispa absorbancia yapakuyninta 436 nm (A436), chaymanta PPO ruwayqa tupukurqa grabaspa fluctuaciones de absorbancia 495 nm (A495) sapa 30 s 3 min UV-160A nisqawan espectrofotómetro (Shimadzu, Japón suyupi).
Chiqa pacha RT-PCR kaqwan ruwakurqa kay niveles de transcripción kimsa antioxidante kaqwan tupaq genes kaqmanta tarinapaq, kay catalasa peroxisómica (PvCAT1; GenBank Accesión No. KF033307.1), superóxido dismutasa (PvSOD; GenBank Accession No. XM_068639556.1), chanta glutatión reductasa (PvGR; GenBank Accession No. KY195009.1), habas raphikunapi (iskay kaq, kimsa kaq hunt’asqa wiñasqa raphikuna patamanta) 72 h qhipa hampiymanta. Pisi rimayllapi, ARN nisqa t’aqasqa karqan Simply P Total RNA Extraction Kit (Cat. No. BSC52S1; BioFlux, Biori Technology, China) nisqawan ruwaqpa protocolonman hina. Chaymantaqa, ADNc nisqatam sintetizarqaku TOP scriptTM cDNA Synthesis Kit nisqawan ruwaqpa kamachisqanman hina. Chay kimsa patamanta genes nisqapa secuencias de cebadores nisqakunam Tabla Suplementaria S3 nisqapi churasqa kachkanku. PvActin-3 (GenBank accesión yupay: XM_068616709.1) wasi qhaway gen hina llamk’achikurqa chanta kay relativa gen expresión yupasqa karqa kay 2-ΔΔCT métodowan (Livak chanta Schmittgen, 2001). Estabilidad de actina nisqa estrés biótico nisqapi (interacción incompatible nisqa legumbres comunes nisqawan hongo antracnosa nisqawan Colletotrichum lindemuthianum nisqawan) chaymanta estrés abiótico nisqawan (ch’akiy, kachi, pisi temperatura) rikuchikurqa (Borges et al., 2012).
Qallariypiqa ruwarqayku huk genoma-niraq in silico análisis de oxaloacetato acetilhidrolasa (OAH) proteínas S. sclerotiorumpi kay proteína-proteína BLAST herramienta (BLASTp 2.15.0+) (Altschul et al., 1997, 2005). Pisi rimayllapi, OAH nisqatam Aspergillus fijiensis CBS 313.89 (AfOAH; táxido: 1191702; GenBank nisqaman yaykuy yupay XP_040799428.1; 342 aminoácidos) nisqamanta, Penicillium lagena nisqamanta (PlOAH; táxido: 94218; GenBank nisqaman yaykuy yupayta) llamkachirqayku XP_056833920.1; BLASTp ruwakurqa kay aswan qhipa tarikuq S. sclerotiorum genoma willaykunawan kay GenBank kaqpi kay Centro Nacional de Información Biotecnología (NCBI) web kitipi, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/.
Hinallatahmi, chay S. sclerotiorum (SsOAH) nisqamanta willasqa OAH gen nisqapas chaynallataq A. fijiensis CBS 313.89 nisqamanta AfOAH nisqapa sacha filogenética nisqapas chaymanta P. lagena nisqamanta PlOAH nisqapas inferisqa karqan chay método de máxima probabilidad nisqawan MEGA11 nisqapi (Tamura et al., 2021) chaynallataq modelo basado en matriz JTT nisqawan (Jones et al., 1992 watapi). Kay filogenético sachaqa hukllawakurqa achka alineación anlisis kaqwan secuencias proteicas kaqwan tukuy predicado OAH genes (SsOAH) kaqmanta S. sclerotiorum kaqmanta chaymanta tapuy secuenciawan kay Constraint-Based Alignment Tool (COBALT; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/re_cobalt.cgi) kaqwan (Papadopoulos chaymanta Agarwala, 2007 watapi). Hinallataq, aswan allin tupaq secuencias aminoácidos SsOAHmanta S. sclerotiorummanta, tapuy secuenciakunawan (AfOAH y PlOAH) (Larkin et al., 2007) ClustalW (http://www.genome.jp/tools-bin/clustalw) nisqawan tupachisqa karqa, chaymanta alineacionpi waqaychasqa regiones nisqakuna qawarisqa karqa ESPript herramientawan (versión 3.0; https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php nisqa yachay wasi).
Chaymantapas, chay dominios representativos funcionales nisqa willasqa chaymanta sitios conservados nisqa S. sclerotiorum SsOAH nisqamantaqa interactivamentem hukniray ayllukunapi rakisqa karqaku InterPro nisqa yanapakuywan (https://www.ebi.ac.uk/interpro/) (Blum et al., 2021). Tukuyninpiqa, kimsa dimensional (3D) estructura modelado kay S. sclerotiorum SsOAH willasqamanta ruwakurqa kay Protein Homology/Analogy Recognition Engine kaqwan (Phyre2 servidor versión 2.0; http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.cgi?id=index) (Kelley et al., 2015) chanta validasqa karqa kay llamk’achispa chay SWISS-MODEL sirwiq (https://swissmodel.expasy.org/) (Biasini et al., 2014). Chay willasqa kimsa dimensional estructuras (formato PDB) nisqakunam interactivamente qawarisqa karqa UCSF-Chimera paquete nisqawan (versión 1.15; https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ ) (Pettersen et al., 2004).
PCR cuantitativa real-time fluorescencia kaqwan ruwakurqa kay nivel transcripcional kay oxaloacetato acetilhidrolasa (SsOAH; GenBank yupay accesión: XM_001590428.1) kaqmanta kay micelio kaqpi kay Sclerotinia sclerotiorum kaqmanta. Pisi rimayllapi, S. sclerotiorum inoculasqa karqa huk matrazpi PDB nisqayuqpi hinaspa churakurqa huk incubadora kuyuchiqpi (modelo: I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, EE.UU.) 25 ± 2 °C nisqapi 24 h 150 rpm nisqapi hinallataq sapa kuti tutayaqpi (24 h) micelio wiñayninta kallpanchanapaq. Chaymantaqa, células nisqakunatam tratarqaku L-ornitinawan hinaspa fungicida Rizolex-Twan IC50 concentraciones finales nisqapi (yaqa 40 hinaspa 3,2 mg/L, respetuosamente) chaymantam cultivarqaku huk 24 h chayna condicionkunapi. Incubacionmantaqa, culturakunatam centrifugarqaku 2500 rpm nisqapi 5 min hinaspam chay sobrenadante (micelio hongo) nisqa huñurqaku análisis de expresión génica nisqapaq. Chaynallataqmi, micelio hongo nisqa huñusqa karqa 0, 24, 48, 72, 96, 120 h infección qipapi, infectasqa yurakunamanta, chaykunam yuraq moho nisqawan micelio algodón nisqawan ruwasqa karqa infectasqa tejidos nisqapa hawanpi. ARN nisqatam hurqurqaku micelio hongo nisqamanta chaymantam ADNc nisqatam sintetizarqaku ñawpaqpi willakusqanman hina. SsOAHpaq secuencias de cebadores nisqakunam Tabla Suplementaria S3 nisqapi churasqa kachkanku. SsActin (GenBank accesión yupay: XM_001589919.1) wasi qhaway gen hina llamk’achikurqa, chanta expresión génica relativa yupasqa karqa kay 2-ΔΔCT métodowan (Livak chanta Schmittgen, 2001).
Ácido oxálico nisqatam tarirurqaku papa dextrosa caldo (PDB) nisqapi chaynallataq planta muestrakunapipas, chaypim kachkan patógeno hongo Sclerotinia sclerotiorum nisqapas, Xuwan Zhangwan (2000) ruwasqankuman hina, pisilla modificacionkunawan. Pisi rimayllapi, S. sclerotiorum aislados nisqakunam inoculasqa karqa matrazkunapi PDB nisqayuqpi chaymantam cultivasqa karqa incubadora de shaking nisqapi (modelo I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, USA) 150 rpm nisqapi 25 ± 2 °C nisqapi 3–5 punchaw sapa kuti tutayaqpi (24 h) micelio wiñayninta kallpanchanapaq. Incubacionmanta, ñawpaqtaqa cultivo de hongos nisqatam filtrarqaku Whatman #1 filtro papelwan, chaymantam centrifugarqurqaku 2500 rpm nisqapi 5 min, chaynapi micelio residual nisqa hurqunapaq. Chay sobrenadante nisqa huñusqa hinaspa 4°C nisqapi waqaychasqa karqa aswan determinación cuantitativa de oxalato nisqapaq. Yurakunapa muestrakuna ruwanapaqqa, yaqa 0,1 g yurakunapa tejidon fragmentokunatam kimsa kutita hurqurqaku yaku destiladawan (2 ml sapa kuti). Chaymantaqa muestrakunatam centrifugarqaku 2500 rpm nisqapi 5 min, chaymantam chay sobrenadante nisqa ch’aki filtrasqa karqa Whatman No. 1 filtrado papelwan hinaspam huñusqa karqa aswan análisis ruwanapaq.
Análisis cuantitativo de ácido oxálico nisqapaqqa, chay mezcla de reacción nisqatam ruwarqaku tubo tapón de vidrio nisqapi kay ordenpi: 0,2 ml muestra (utaq filtrado de cultivo PDB utaq solución estándar de ácido oxálico), 0,11 ml azul bromofenol (BPB, 1 mM; Fisher Chemical, Pittsburgh, PA, EE.UU.), 0,198 ml ácido sulfúrico 1 M (H2SO4; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, El Cairo, Egipto) chaymanta 0,176 ml 100 mM dicromato potasio (K2Cr2O7; TCI químicos, Portland, OR, EE.UU.) nisqawan, chaymantataqmi chay solucionta 4,8 ml nisqaman destilada yakuwan chulluchirqaku, kallpawan chaqruspa chaylla 60 °C yakupi churarqaku aywikuna. 10 minmantaqa, 0,5 ml hidróxido de sodio solución (NaOH; 0,75 M) nisqawanmi chay reacción nisqataqa sayachirqaku. Chay absorbancia (A600) nisqa chay mezcla de reacción nisqa tupusqa 600 nm nisqapi espectrofotómetro UV-160 nisqawan (Shimadzu Corporation, Japón). PDB nisqawan yaku destilada nisqawanmi control hina churakurqa filtros de cultivo nisqapa cuantificación nisqapah, chaynallataq muestra de plantas nisqapas, chayman hina. Chay filtros de cultivo nisqapi ácido oxálico nisqapa concentracionnin, microgramos de ácido oxálico nisqa sapa mililitro medio PDB nisqapi (μg.mL−1) nisqa, chaynallataq raphimanta hurqusqakunapi, microgramos de ácido oxálico nisqa sapa gramo musuq llasayninpi (μg.g−1 FW) nisqa, chaymi tarikurqa curva de calibración de ácido oxálico nisqawan (Thermo Fisher Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA).
Tukuy yachaypiqa, tukuy experimentokuna ruwakurqa huk diseño completamente aleatorizado (CRD) nisqapi, sapa hampiypi suqta replicados biológicos nisqawan, sapa replicado biológico nisqapi pichqa mankakunawan (iskay planta sapa mankapi) mana huk nisqa kaptinqa. Replicados biológicos nisqakunam iskay kutipi (iskay replicados técnicos) qawarisqa karqa. Chay kikin experimentopa reproducibilidad nisqa qawarinapahmi replicados técnicos nisqawan ruwakurqa ichaqa manam análisis estadístico nisqapiqa servichikurqakuchu mana replicaciones espurias nisqakuna kananpaq. Datos nisqakunam estadísticamente analizasqa karqa análisis de varianza (ANOVA) nisqawan chaymanta prueba Tukey-Kramer honestamente significativa diferencia (HSD) nisqawan (p ≤ 0.05). Experimentos in vitro kaqpaq, IC50 chaymanta IC99 valores yupasqa karqa kay modelo probit kaqwan chaymanta 95% intervalos de confianza yupasqa karqa.
Llapanpiqa tawa aislados nisqakunam huñusqa karqa imaymana soya chakrakunamanta, El Ghabiya Gobernadorapi, Egipto suyupi. PDA mediopiqa, llapa aislados nisqakunam cremoso yuraq micelio nisqa ruwarqaku chaymi utqaylla algodón nisqa yuraqman tikrakurqa (1A siqi) chaymantam beige utaq marrón nisqaman tikrakurqa esclerocio nisqa etapapi. Esclerotios nisqakunaqa aswantaqa denso, yana, esférico utaq irregular nisqa rikchayniyuqmi, 5,2manta 7,7 mmkama suniyuqmi, 3,4manta 5,3 mmkama diámetroyuqmi (1B siqi). Tawa aislados nisqakunam wiñachirqaku huk patrón marginal de esclerotia nisqa chay medio de cultivo nisqapa kantunpi 10–12 punchaw incubación nisqamanta 25 ± 2 °C nisqapi (Fig. 1A), chay esclerotia nisqapa yupayninqa sapa placa nisqapiqa anchatam hukniraq karqa paykunapurapi (P < 0,001), aislado 3 nisqapiqa aswan achka esclerotia nisqayuqmi sapakama placa; Chaynallataqmi, aislado #3 aswan achka ácido oxálico nisqa PDB nisqapi ruwarqa huk aisladokunamantaqa (3,33 ± 0,49 μg.mL−1; Fig. 1D). Aislado #3 rikuchirqa típicas características morfológicas y microscópicas kaqta kay hongo fitopatógeno Sclerotinia sclerotiorum kaqmanta. Ejemplopaq, PDA nisqapiqa, colonias de aislado #3 nisqa usqhaylla wiñarqanku, cremoso yuraq karqanku (Figura 1A), inverso beige utaq llamp’u salmón q’illu-marrón, chaymi 6-7 p’unchawta necesitarqanku 25 ± 2°C nisqapi 9 cm diámetro nisqa placapa hawanta hunt’asqata tapanankupaq. Chay hawapi kaq características morfológicas y microscópicas nisqapi hapipakuspam, aislado #3 nisqa riqsichikurqa Sclerotinia sclerotiorum nisqa.
Siqi 1. Características y patogenicidad nisqa S. sclerotiorum nisqamanta aislados nisqakuna comun legumbre tarpuykunamanta. (A) Tawa S. sclerotiorum aislados nisqamanta micelio wiñaynin kay medio PDA nisqapi, (B) esclerotia tawa S. sclerotiorum aislados nisqamanta, (C) yupay esclerotia nisqamanta (sapa placa), (D) secreción de ácido oxálico nisqamanta medio PDB nisqapi (μg.mL−1), hinallataq (E) unquypa sinchi kaynin (%) tawa S. sclerotiorum aislados nisqamanta legumbre comercial susceptible nisqapi cultivar Giza 3 invernadero nisqapi. Valores nisqakunam qawarichinku promedio ± SD nisqa pichqa replicados biológicos nisqamanta (n = 5). Hukhina qillqakunam qawarichin estadísticamente significativas diferencias kaqta hampikunapura (p < 0,05). (F–H) Sintomas típicos de moho yuraq kaqmanta rikhurirqa kay patamanta tallos kaqpi chanta kay sílices kaqpi, respetuosamente, 10 p’unchawkuna inoculación kaqmanta kay aislado #3 (dpi) kaqwan. . Chay huñusqa chirukunapa hawanpi yupaykunaqa suyupa qatakuynintam qawarichin (%), huñusqa chirukunapa urayninpi yupaykunapas ramapa sayaynintam qawarichin.
Chaymantapas, chay patogenicidad nisqa takyachinapaqmi tawa aislados de S. sclerotiorum obtenidos nisqawan inocularqaku chay susceptible cultivar de habas comerciales Giza 3 nisqa invernadero nisqapi, chaymi tupan Kochpa postulacionninkunawan (Fig. 1E). Llapan aislados hongos obtenidos nisqakuna patógenos kaptinkupas, verde habas nisqatapas (cv. Giza 3) infectayta atinkuman, chaymi sintoma típico yuraq moho nisqamanta llapa allpa hawapi kaq partekunapi (Fig. 1F), aswantaqa saphikunapi (Fig. 1G) chaynallataq vainas nisqapipas (Fig. 1H) 10 punchaw inoculacionmanta (dpi), aislado 3 aswan agresivo aislado iskay independiente experimentokunapi. Aislado 3 nisqa aswan hatun unquypa sinchi kayninta (%) habas yurakunapi (24,0 ± 4,0, 58,0 ± 2,0, 76,7 ± 3,1 7, 14, 21 punchaw infección nisqamanta, chaymanta; Figura 1F).
Chay riqsichiyqa aswan invasivo S. sclerotiorum aislado #3 nisqamanta aswanta takyachisqa karqan secuenciación espaciador transcrito interno (ITS) nisqapi (Fig. 1I). Análisis filogenético nisqa aislado #3 nisqawan 20 aislados/cepas de referencia nisqawanmi qawarichirqa hatun rikchakuy (>99%) paykunapura. Chaynapim qawarina, chay S. sclerotiorum aislado #3 (533 bp) nisqa hatun rikchakuyniyuqmi chay S. sclerotiorum aislado americano LPM36 nisqawan, ch’aki guisante muhumanta (GenBank accesión numero MK896659.1; 540 bp) chaynallataq China S. sclerotiorum aislado YKY211 (GenBank acceso numero OR206374.1; Kay musuq secuenciaqa churasqa kachkan kay NCBI base de datos kaqpi chanta sutichasqa kachkan “Sclerotinia sclerotiorum – aislar YN-25” (GenBank acceso número PV202792). Rikukunmi aislado 3 aswan invasivo aislado kasqan; chayraykum kay aislado nisqa akllasqa karqa tukuy qatiqnin experimentokunapi estudianapaq.
Kay actividad antibacteriana kay diamina L-ornitina (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Alemania) kaqmanta hukniray concentraciones kaqpi (12,5, 25, 50, 75, 100 chanta 125 mg/L) kay S. sclerotiorum aislado 3 kaqmanta kay in vitro kaqpi investigasqa karqa. Reparanapaqmi kay L-ornitina huk efecto antibacteriano kaqta ruwarqa chaymanta pisi pisimanta hark’arqa kay radial wiñayninta kay S. sclerotiorum hyphae kaqmanta huk dosismanta dependiente kaqpi ( Figura 2A, B ). Aswan hatun concentración pruebasqa kaqpi (125 mg/L), L-ornitina rikuchirqa aswan hatun tasa inhibición micelio wiñayninmanta (99,62 ± 0,27%; Figura 2B), kaytaq equivalente karqa kay fungicida comercial Rizolex-T kaqwan (tasa de inhibición 99,45 ± 0,39%; Figura 2C) aswan hatun concentración pruebasqa kaqpi (10 mg/L), chaymi rikuchirqa kaqllata eficacia nisqa.
Siqi 2. L-ornitina nisqapa actividad antibacteriana in vitro nisqapi Sclerotinia sclerotiorum nisqapa contranpi. (A) Comparación kay actividad antibacteriana kaqmanta hukniray concentraciones kaqmanta kay L-ornitina kaqmanta kay S. sclerotiorum kaqmanta kay fungicida comercial Rizolex-T (10 mg/L) kaqwan. . Valores nisqakunam qawarichinku promedio ± SD nisqa pichqa replicados biológicos nisqamanta (n = 5). Chikan chikan qillqakunam hampikunapura estadística nisqapi hukniray kayninta qawarichin (p < 0,05). (D, E) Análisis de regresión modelo Probit nisqamanta L-ornitinamanta chaymanta fungicida comercial Rizolex-Tmanta, chaymanta. Chay probit modelo regresión chiruqa qawarichikunmi huk solido azul chiru hina, chaymantam qawarichikun intervalo de confianza (95%) huk chiru puka chiru hina.
Hinallatahmi, anlisis de regresión de probit nisqa ruwakurqa chaymantam chayman hina parcelas nisqakuna qawarisqa kachkan Tabla 1 nisqapi chaynallataq Figuras 2D,E nisqapipas. Pisi rimayllapi, chay valor de pendiente aceptable (y = 2,92x − 4,67) chaymanta asociadas estadísticas significativas (Cox & Snell R2 = 0,3709, Nagelkerke R2 = 0,4998 chaymanta p < 0,0001; Figura 2D) kay L-ornitinamanta rikuchirqa huk actividad antifúngica kallpachasqa kay S. sclerotiorum kaqwan tupachisqa kay fungicida comercial kaqwan Rizolex-T (y = 1,96x − 0,99, Cox & Snell R2 = 0,1242, Nagelkerke R2 = 0,1708 y p < 0,0001) (Tabla 1).
Tabla 1. Valores de concentración inhibidora medio máxima (IC50) chaymanta IC99 (mg/l) kaqmanta kay L-ornitina kaqmanta chanta kay fungicida comercial “Rizolex-T” kaqmanta kay S. sclerotiorum kaqmanta.
Tukuypiqa, L-ornitina (250 mg/L) nisqa, yuraq moho wiñayninta, sinchi kayninta ima, hampisqa común habas yurakunapi, mana hampisqa S. sclerotiorumwan unqusqa yurakunawan tupachisqaqa, anchata pisiyachirqa (control; Figura 3A). Pisi rimayllapi, mana hampisqa infectasqa control yurakunamanta unquypa sinchi kaynin pisi pisimanta yapakuptinpas (52,67 ± 1,53, 83,21 ± 2,61, 92,33 ± 3,06%), L-ornitinaqa unquypa sinchi kaynintam anchata pisiyachirqa (%) tukuy experimentopi (8,97 ± 0,15, 18,00 ± 1,00, chanta 26,36 ± 3,07) 7, 14, 21 p’unchaw hampiymanta (dpt), sapakama (3A siqi). Chaynallataqmi, S. sclerotiorumwan infectasqa habas yurakunata 250 mg/L L-ornitinawan hampichiptinkuqa, chay área nisqa curva de progresión de enfermedad (AUDPC) nisqapa urayninpiqa pisiyarurqa 1274,33 ± 33,13 nisqamanta mana hampisqa controlpi 281,03 ± 7,95 nisqaman, chaymi aswan pisilla karqa control positivo nisqamanta 50 mg/L nisqamanta Rizolex-T fungicida (183,61 ± 7,71; Fig. 3B). Chaynallataqmi iskay kaq experimentopipas qawarikurqa.
Fig. 3. Efecto de la aplicación exógena de L-ornitina nisqa yuraq ismuyninpa wiñayninpi habas comunes nisqapa ruwasqan Sclerotinia sclerotiorum nisqawan invernadero nisqapi. (A) Curva de progresión de enfermedad nisqa yuraq moho de habas común nisqamanta, 250 mg/L L-ornitinawan hampichikusqanmanta. (B) Área bajo la curva de progresión enfermedad (AUDPC) yuraq moho de habas común nisqamanta L-ornitinawan hampichikuptin. Valores nisqakunam qawarichinku promedio ± SD nisqa pichqa replicados biológicos nisqamanta (n = 5). Chikan chikan qillqakunam hampikunapura estadísticamente significativa diferenciakunata qawarichin (p < 0,05).
250 mg/L L-ornitina exógena nisqawan churayqa pisi pisimantam yurakunapa sayayninta yaparun (Sig. 4A), hayka kallmakuna sapa yurapi (Sig. 4B), chaynallataq hayka raphikuna sapa yurapi (Sig. 4C) 42 punchawmanta. Mientras kay fungicida comercial Rizolex-T (50 mg/L) aswan hatun efectota ruwarqa tukuy parámetros nutricionales estudiasqapi, aplicación exógena 250 mg/L L-ornitinamanta iskay kaq aswan hatun efectota ruwarqa mana hampisqa controlkunawan tupachisqa (Figs. 4A–C). Hukninpiqa, L-ornitina hampiyqa manam ima hatun ruwayniyuqchu karqa pigmento fotosintético clorofila a (Fig. 4D) hinaspa clorofila b (Fig. 4E) nisqapa contenidonpi, ichaqa pisillatam yaparqa llapan carotenoides nisqa contenidota (0,56 ± 0,03 mg/g fr wt) control negativowan tupachisqa (0,44 ± 0,02 mg/g fr wt) chaynallataq control positivo (0,46 ± 0,02 mg/g fr wt; Fig. 4F). Tukuypiqa, kay ruwasqakunaqa qawarichinmi L-ornitina mana fitotóxica kasqanmanta hampisqa legumbrekunapaq hinaspapas wiñayninkutapas kallpanchanmanmi.
Fig. 4. Efecto de la aplicación exógena de L-ornitina nisqa wiñayninpa características nisqapi chaymanta pigmentos fotosintéticos nisqapi Sclerotinia sclerotiorum nisqawan infectasqa habas raphikunapi invernadero nisqapi. (A) Yurakunapa sayaynin (cm), (B) Hayka kallmakuna sapa yurapi, (C) Hayka raphikuna sapa yurapi, (D) Clorofila a nisqa (mg g-1 fr wt), (E) Clorofila b nisqa (mg g-1 fr wt), (F) Llapan carotenoides nisqa (mg g-1 fr wt). Valores nisqakunam kanku promedio ± SD pichqa replicados biológicos nisqamanta (n = 5). Hukhina qillqakunam qawarichin estadísticamente significativas diferencias kaqta hampikunapura (p < 0,05).
Localización histoquímica in situ kaqmanta especies de oxígeno reactivo kaqmanta (ROS; expresasqa peróxido de hidrógeno [H2O2]) chaymanta radicales libres (expresasqa aniones superóxidos [O2•−]) kaqmanta rikuchirqa kay aplicación exógena kay L-ornitina kaqmanta (250 mg/L) anchata pisiyachirqa kay acumulación kay H2O2 kaqmanta (96,05 ± 5,33 nmol.g−1 FW; Fig. 5A) hinallataq O2•− (32,69 ± 8,56 nmol.g−1 FW; Fig. 5B) iskaynin mana hampisqa infectasqa yurakunapa huñukuyninwan tupachisqa (173,31 ± 12,06 hinaspa 149,35 ± 7,94 nmol.g−1 FW, chaymanta) chaynallataq yurakuna 50 mg/L comercial fungicidawan hampisqa Rizolex-T (170,12 ± 9,50 y 157,00 ± 7,81 nmol.g−1 fr wt, chaymanta) 72 h. Alto niveles de H2O2 y O2•− huñusqa hpt nisqapi (Fig. 5A, B). Chaynallataqmi, ensayo de malondialdehído (MDA) basado en TCA nisqapiqa qawarikurqa S. sclerotiorumwan infectasqa habas yurakunapas raphinkupi aswan hatun niveles de MDA (113,48 ± 10,02 nmol.g fr wt) huñusqankuta (Fig. 5C). Ichaqa, L-ornitinapa exógena nisqa churayqa anchatam pisiyachirqa peroxidación lípida nisqataqa, chaymi qawarikun hampisqa yurakunapi MDA nisqa pisiyasqanwan (33,08 ± 4,00 nmol.g fr wt).
Fig. 5. Efecto de la aplicación exógena de L-ornitina nisqa hatun marcadores nisqapi estrés oxidativo nisqapi chaymanta mecanismos de defensa antioxidante no enzimático nisqapi habas raphikunapi S. sclerotiorumwan infectasqapi 72 h infección qipapi condiciones de invernadero nisqapi. (A) Peróxido de hidrógeno (H2O2; nmol g−1 FW) 72 hpt nisqapi, (B) anión superóxido (O2•−; nmol g−1 FW) 72 hpt nisqapi, (C) malondialdehído (MDA; nmol g−1 FW) 72 hpt nisqapi, (D) tukuyninpi fenólicos solubles (mg GAE g−1 FW) 72 hpt nisqapi, (E) tukuyninpi flavonoides solubles (mg RE g−1 FW) 72 hpt nisqapi, (F) tukuyninpi libre aminoácidos (mg g−1 FW) 72 hpt nisqapi, (G) contenido de prolina (mg g−1 FW) 72 hpt nisqapi. Valores nisqakunam qawarichinku promedio ± desviación estándar (promedio ± DS) nisqa 5 replicados biológicos nisqamanta (n = 5). Hukhina qillqakunam qawarichin estadísticamente significativas diferencias kaqta hampikunapura (p < 0,05).