Kay secretora ñanpi proteína t’aqayqa ancha allinmi kay compartimentación celular chanta homeostasis kaqta waqaychaypaq. Aswanta kay cáscara-mediada clasificación kaqmanta, kay lípidos kaqpa ruwaynin kay kinesina clasificación kaqpi kay proceso de transporte secreto kaqpi huk unaymantapacha tapuy básica kaqmanta manaraq kutichisqachu. Kaypi, ruwayku 3D simultáneo multicolor alto-resolución chiqa pacha imajinas pruebapaq in vivo pruebapaq kay musuq sintetizadas glicosilfosfatidilinositol-inmovilizadas proteínas ancha unay ceramida lípido fracciones kaqwan agrupasqa kachkanku chaymanta clasificasqa kanku kay endoplasmas especializadas kaqpi Net lluqsiy sitio kaqpi, kaytaq hukniraq kay transmembrana proteínas kaqwan llamk’achisqankumanta. Chaymantapas, qawachinchikmi ceramidapa cadena largon membrana retículo endoplásmica nisqapi ancha allin kasqanmanta kay selectividad de clasificación nisqapaq. Kay yachayniykuqa ñawpaq prueba directa in vivo kaqpi qun kay cargas proteicas kaqta clasificanapaq kay cadena lipídica largo kaqpi kay selectivo sitios de exportación kaqpi kay secretora ñanpi.
Células eucariotas nisqapiqa, retículo endoplásmico (ER) nisqapi sintetizasqa proteínas nisqakunam chaymantaqa t’aqasqa kanku transporte nisqapi secretora ñanninta, chaynapi maymanchus celularninkuman chayanankupaq (1). Aswanta kay capa-mediada clasificación kaqmanta, unaymantaña especulasqa karqa wakin lípidos kaqkunapas kay selectivo puntos de salida hina serviyta atinku kay agrupaspa kay dominios específicos de membrana kaqpi kay proteínas específicas kaqpi ( 2-5 ). Ichaqa, kunankamapas mana kanchu prueba directa in vivo kaqpi kay atikuq mecanismo lipídico kaqpi pruebananpaq. Kay sasachakuy básico allichanapaqmi, levadurapi estudiarqayku imaynatas proteínas ancladas de glicosilfosfatidilinositol (GPI) (GPI-APs) nisqakuna diferencialmente ER nisqamanta hawa llaqtakunaman apachisqa kanku chayta. GPI-APs huk laya lipídicowan tinkisqa célula hawa proteínas kanku ( 6, 7 ). GPI-AP nisqaqa huk lluqsisqa prutinam, plasma membrana nisqap hawa raphinkunaman k'askasqa, glicolípido nisqap rakinwan (GPI ancla). Paykunaqa GPI anclajekunata chaskinku conservador post-traduccional modificaciones hina kay ER lumen kaqpi (8). K’askakusqanmanta qhipaman, GPI-AP aparato Golgi (5, 9) kaqninta ER kaqmanta kay membrana plasmática kaqman pasakun. Kay GPI anclajes kaqpa kayninqa kay GPI-AP kaqta sapanmanta apaykachakun kay transmembrana secretada proteínas kaqmanta (huk proteínas kay membrana plasmática kaqmanta) kay secretora ñanninta ( 5 , 9 , 10 ). Células de levadura kaqpi, GPI-APs huk proteínas secretadas kaqkunamanta t’aqakunku kay retículo endoplásmico kaqpi, chaymanta kay sapalla vesículas kaqkunaman paquetechasqa kanku kay complejo proteico de capa II (COPII) kaqwan p’istuykusqa (6, 7). Kay determinantes kay proceso de clasificación kaqmanta kay proceso de exportación ER kaqpi mana sut’ichu kanku, ichaqa kay mecanismo lípidos kaqta necesitanman, aswanta kay remodelación estructural kaqmanta kay porción lípida kaqmanta kay ancla GPI kaqmanta ( 5 , 8 ). Levadura kaqpi, GPI lipídico remodelación qallarikun chaylla kay GPI k’askakusqanmanta, chanta achkha kutipi, kay ceramida kaqta kay 26 carbono largo cadenayuq ácido graso saturado kaqman (C26:0) hukllanakunanpaq ruwan (11, 12). C26 ceramida nisqaqa kunankama levadura nisqap células nisqap hatun ceramida nisqap rurasqanmi. Kayqa sintetizakun kay ER kaqpi chanta aswan achkan kay aparato Golgi kaqman apachisqa kay vesículas COPII kaqnintakama ( 13 ). Kay ER exportación kay GPI-AP kaqmanta específicamente necesitan kay síntesis ceramida kaqta purichkaqta ( 14 , 15 ), chanta kay kutinpi, kay ceramida kay ceramida kay inositol fosfato ceramida kaqman (IPC) tikray kay aparato Golgi kaqpi dependen kay síntesis de anclaje GPI kaqmanta ( 16 ). Estudios biofísicos kay membranas artificiales kaqwan rikuchirqanku kay ancha largo cadena acil ceramidas kaqwan hukllanakunkuman kay ordenados dominios kaqta ruwanankupaq kay sapalla propiedades físicas kaqwan ( 17 , 18 ). Kay willaykunaqa kay hipótesis kaqman pusanku kay C26 ceramida chanta kay GPI-AP kay C26 ceramida kaqwan kay propiedades físicasninkuta llamk’achinku kay ordenada regiones kaqman utaq regiones kaqman kay relativamente desordenado ER membrana lípido pachamamapi hukllanakunankupaq. Aswantaqa pisilla hinaspa mana saturado glicerolípidos (C16:1 y C18:1) nisqamanta ruwasqam (19, 20). Kay regiones selectivamente enfocada kanqa kay sitios específicos de salida ER (ERES) kaqpi, maypichus kay ceramida chanta kay ceramida-based GPI-AP kaqwan co-transportada kay Golgi kaqman kay kikin dedicado vesícula COPII kaqpi (5).
Kay yachaypiqa, chiqanmanta pruebarqayku kay lipídico nisqapi ruwasqa mecanismota microscopía de imagen confocal real-time (SCLIM) nisqawan, kayqa huk técnica microscopía de punta nisqa, chaymi huk kutillapi qhawayta atin proteínas etiquetadas fluorescentes nisqakunata Kimsa llimp’iyuq, kimsa dimensional (3D) nisqa siq’ikunaqa ancha hatun resolución nisqayuq chanta usqhaylla kawsaq células nisqapi (21, 22).
Ñawpaqtaqa SCLIM tecnologiata churarqayku aswanta riqsichinaykupaq imaynatachus normal GPI-AP C26 ceramida qutuwan cribado karqa kay transmembrana secretada proteínasmanta kay ERmanta lluqsispa kay S. cerevisiae kaqpi. ERpa clasificacionninta qawanapaqmi, huk sistema genético nisqawan yanapachikurqayku, chaymi chiqaptapuni qawayta atin musuq sintetizado carga ERES nisqaman yaykuqta in vivo nisqapi ( 7 , 23 ). Carga hina, akllarqayku C26 ceramida-based GPI-AP Gas1 etiquetado kay verde fluorescente proteína (GFP) kaqwan chanta kay transmembrana secretada proteína Mid2 etiquetada kay cerca-infrarrojo fluorescente proteína kaqwan (iRFP), kay iskayninku kay membrana plasmática kaqman diriginku ( 24–26 ). Kay sec31-1 temperatura-sensible mutante kaqpi, kay iskay cargas expresasqa kanku huk promotor inducible galactosa kaqwan chanta huk marcador ERES constitutivo kaqwan. Kay sinchi q’uñipi (37°C), imaraykuchus kay sec31-1 mutación afectan kay COPII capa componente Sec31 ruwayninta hark’ananpaq kay COPII germinación chanta kay ER exportación kaqpi, kay musuq sintetizado carga huñukun kay ER kaqpi (23). Pisi ruphayman (24°C) q’uñichisqa kaptin, sec31-1 mutante células nisqakuna secretora nisqamanta kutirimurqanku, chaymantataqmi huñusqa musuq carga sintética nisqa ER nisqamanta hawa llaqtakunaman apachiyta qallarirqanku. CLIM rikuchiyqa rikuchirqa aswan achka musuq sintetizado Gas1-GFP chaymanta Mid2-iRFP huñusqaraq kasqankuta kay ER kaqpi kay sec31-1 mutante células kaqpi incubación kaqmanta 37°C kaqpi chaymanta kacharisqa 24°C kaqpi 5 minutos kaqpi (Figura 1). Mid2-iRFP tukuy membrana ER nisqapi rakisqa kasqanrayku, chaymanta Gas1-GFP nisqa membrana ER discontinua nisqapi huñusqa kasqanrayku, chaymi rakikuyninkuqa tukuy imamanta hukniraq (Figura 1, A a C y Película S1). Hinallatahmi, 1D siqipi qawarisqanchikman hinaqa, Gas1-GFP clusterqa manam Mid2-iRFP nisqayuqchu. Kay ruwakuykuna rikuchinku kay GPI-AP chanta kay transmembrana proteínas kaqkuna t’aqasqa karqanku kay hukniray ER membrana regiones kaqpi ñawpaqmanta. Kay Gas1-GFP clusterqa huk ERES específico kaqwan kuska kachkan, kay mCherrypa COPII capa proteína Sec13 kaqwan etiquetasqa kachkan (1 kaq siq’i, E chanta F, chanta pelicula S1 kaqwan) (23).
sec31-1 células expresanku galactosa-inducida secreciones, huk largo cadena acil (C26) ceramida GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, verde) chaymanta kay transmembrana proteína Mid2-iRFP (TMP, azul) chaymanta kay Constructivo ERES etiquetado Sec13-mCherry (ERES, magenta) incubasqa karqa 37°C 30 minutos, kuyuchisqa 24°C, hinaspa SCLIM nisqawan 5 minutomanta siq’isqa. (Amanta Ckama) rikuchin huk representativa huñusqa utaq sapalla 2D siq'i huk plano (A), huk 2D proyección siq'i 10 z-secciones (B) utaq huk 3D célula hemisferio siq'i carga chaymanta ERES marcadores (C). Barra de escala 1μm (A y B). Chay unidad de escala nisqa 0,551μm (C) nisqa. Gas1-GFP tarikurqa discretas ER regiones utaq clústeres kaqpi, Mid2-iRFP kaqtaq tarikurqa chaymanta tukuy ER membrana kaqpi rakisqa karqa (C). (D) Chay grafico nisqapim qawarikun Gas1-GFPpa, Mid2-iRFPpa relativa intensidad de fluorescencia nisqa chay cluster Gas1-GFP nisqapi yuraq flecha chirupi (ichuqpi). AU, unidad arbitraria. (E y F) nisqakunaqa 3D nisqa siq’itam qawarichin, chaymi mercancías nisqawan ERES marcawan kuskanchakun. Gas1-GFP clústeres nisqakunam tarikurqa chay específico ERES nisqapa hichpanpi. Chay unidad de escala nisqa 0,551μm nisqa. (F) Yuraq qaqa flechaqa ERESwan tupachisqa Gas1-GFP cluster nisqatam riqsichin. Chawpi, paña paneles nisqakunam qawarichinku huñusqa hatunyachisqa 3D siq’ita chaynallataq akllasqa Gas1-GFP clusterpa muyurisqa qawariynintapas.
Chay estrecha relación espacial nisqa cluster Gas1-GFP nisqawan huk ERES específico nisqawanmi qawarichin Gas1-GFP selectivo ERES nisqaman yaykuyta atin, chaymi hukniraq chay selectividad nisqamanta Mid2-iRFP ER nisqamanta lluqsinanpaq. Kay atiyta allichanapaqmi, huk utaq iskay bienes nisqallapaq ERES nisqapa ratio nisqa yupayta ruwarqayku (2 yupay, Amanta Ckama). Tarirqaykutaqmi yaqa llapan ERES (70%) huk laya cargalla kasqanmanta. Chay uray siq’iqa 2C siqipim qawarikun iskay típico ejemplos de ERES nisqa Gas1-GFP nisqallawan (1 yupay) utaq Mid2-iRFP nisqallawan (2 yupay). Chaywanpas, yaqa 20% ERES nisqapiqa iskay cargakunam kachkan, chaykunaqa kikin kitillapim tupan. Chaytahmi tarikurqa wakin ERES (10%) iskay laya cargakuna kasqanmanta, ichaqa sutillam hukniray kitikunapi sapanchasqa karqaku. Chayraykum kay anlisis estadístico nisqa qawarichin ER hawa llaqtakunaman apachisqa kaptin, GPI-AP Gas1-GFP chaymanta carga transmembrana Mid2-iRFP nisqa hukniray ERES nisqapi rakisqa kasqankuta (Figura 2D). Kay eficiencia de clasificación nisqa anchata tupan ñawpaq análisis bioquímico nisqawan (6) chaymanta determinación morfológica nisqawan (7). Hinallataqmi qawarichwan chay carga cuarentena nisqapi ERES nisqaman yaykuqkunapa imayna puririyninta (Figura 2E y Película S2). Figura 2E nisqapim qawarikun huk uchuy partella Gas1-GFP (panel 3) utaq Mid2-iRFP (panel 4) nisqapas huk ladumanta ERES nisqaman yaykun, chaymi huk área discreta nisqapi wichqasqa kachkan. Panel 5 kay Figura 2E kaqmanta rikuchin kay Gas1-GFP chanta Mid2-iRFP wakin kutipi tarikunku kikin ERES kaqpi, ichaqa wak ladumanta yaykunku chanta kay sapaq regiones kaqpi concentrasqa kanku mayqinkunachus hukniray vesículas COPII kaqmanta representankuman. Hinallataq, chiqancharqayku kay qhawasqa t’aqakuy chanta kay clasificación kay C26 ceramida-based GPI-AP Gas1 kaqmanta kay selectivo ERES hina específico kaqta imaraykuchus huk carga secreción transmembrana kaqmanta, kay GFP-etiquetado proteína membrana plasmática Axl2 kaqmanta (27 ), kay Mid2-iRFP kaqman rikch’akuq comportamientota rikuchispa. (S1 siqi hinaspa Película S3). Chay musuq sintetizasqa Axl2-GFPqa Mid2-iRFP hina membrana ER nisqawanmi rakisqa kachkan (S1, A hinaspa B siqi), chaymantam Mid2-iRFPwan kuska localizasqa kachkan aswan achka ERES nisqapi (S1, Bmanta Dkama). Paneles 1 y 2 de la Figura 1. S1C rikuchin iskay ejemplos típicos de ERES maypichus iskay cargas transmembrana nisqakuna tupanakunku. Kay casos nisqapiqa iskaynin mercancías nisqakunan kuskalla ERES nisqaman haykunku (S1E, Panel 3 y Película S3 nisqa siqi).
Chay sec31-1 células expresaq galactosa inducibles secreciones, Gas1-GFP (GPI-AP, verde) hinallataq Mid2-iRFP (TMP, azul) hinallataq constitutivo ERES etiquetado Sec13-mCherry (ERES, magenta) churasqa karqan 37 Incubasqamanta 30 minutos °C, kuyuchiy 24 °C kacharinapaq bloque de secreción, hinallataq imagen SCLIMwan chaymanta 20 minuto. (Amanta Ckama) Representante 2D proyección siq’ikuna (A; barra de escala, 1μm) utaq 3D celular hemisferio siq’ikuna (B y C; unidad de escala, 0,456μm) cargamanta hinallataq 10 z-secciones ERESwan marcasqa. (B) kaqpi uray panel chaymanta (C) kaqpi panel procesado siq'ikunata rikuchinku ERES (magenta) kaqpi kaq bienesllata rikuchinapaq [Gas1-GFP (gris) chaymanta Mid2-iRFP (azul k'anchay)]. (C) Flecha kichasqa: ERESqa huk cargallatam apan (1manta 4kama). Gris flecha: ERES nisqapiqa carga segregada (5) nisqa kachkan. Yuraq sinchi flecha: ERES nisqapi carga co-localizado nisqayuq. Uraypi: Akllasqa sapalla ERES nisqapiqa Gas1-GFP (1) utaq Mid2-iRFP (2) nisqallam kachkan. Barra de escala, 100 nm. (D) (C) nisqapi willasqa fotomicrografía nisqapa cuantificacionnin. Chay promedio porcentaje de ERES nisqa huk cargallata (Gas1-GFP utaq Mid2-iRFP), carga segregada nisqa chaymanta carga superpuesta nisqayuq. Kimsa sapanchasqa experimentokunapi, n=432 54 células nisqapi. Pantasqa barra = SD. Iskay chupayuq mana parisqa t prueba. *** P = 0,0002 nisqa. (E) 3D siq’i akllasqa ERES nisqamanta carga cuarentena nisqamanta (C) nisqawan marcasqa. Gas1-GFP (verde) (3) utaq Mid2-iRFP (azul) (4) huk ladumanta ERES (magenta) nisqaman yaykun, ERES ukupi huk uchuy kitillapim harkasqa. Wakin kutipiqa, iskaynin laya cargakuna kikin ERES (5) nisqaman kikin ladomanta yaykunku, chaymantataq ERES ukupi sapanchasqa kitillapi wichqasqa kanku. Barra de escala, 100 nm.
Chaymanta, pruebarqayku huk hipótesis kaqta kay ceramida de cadena acil larga (C26) kay membrana ER kaqpi kaqta kay agrupación específica chanta clasificación kay Gas1 kaqmanta kay ERES selectivo kaqman purichin. Chaypaqqa, huk cepa de levadura modificada GhLag1 nisqawanmi llamk’achirqayku, chaypin iskay sintasas ceramida endógenas Lag1 nisqawan Lac1 nisqawan GhLag1 nisqawan (algodón nisqamanta Lag1 homólogo) sustituykurqa, chaymi huk cepa de levadura nisqa membrana celular Ceramida cepa nisqawan aswan pisi sallqa layamanta ( Figura 3A ) (28). Análisis de espectrometría de masas (MS) nisqawanmi qawarikurqa sallqa cepas nisqapiqa 95% llapan ceramida nisqamantaqa ancha suni (C26) cadena ceramida nisqa, GhLag1 nisqapiñataqmi 85% ceramida nisqa ancha suni (C18 y C16). ), 2% ceramida nisqallam ancha suni (C26) kadena ceramida nisqa. C18 chaymanta C16 ceramidas kaptinkupas kunankama GhLag1 membranapi tarisqa ceramidas principales kaptinkupas, análisis MS nisqapas chiqancharqataqmi chay ancla GPI Gas1-GFP expresasqa kay cepa GhLag1 nisqapi C26 ceramida nisqayuq kasqanmanta, chaymi tupachisqa kanman sallqa lípidos nisqawan. Chay allin kayninqa kaqllam (Sig. 3A) (26). Chayrayku, kayqa niyta munan kay enzima remodeladora de ceramida Cwh43 ancha akllaqmi C26 ceramidapaq, imaynan rikukun 26 siq’ipi hina, aswan allinta churan kay ancla GPI nisqa pisi ceramida C26 nisqamanta kay cepa GhLag1 nisqapi. S2 (29) nisqa. Chaywanpas, kay GhLag1 kaqpa membrana celularninqa básicamente C18-C16 ceramidallata hap’in, Gas1-GFPtaq C26 ceramidallata hap’in. Kay chiqapmi kay cepa nisqa huk allin herramientata ruwan específicamente allichanapaq chay problemata chay cadena acil nisqapa largonmanta ceramida de membrana nisqamanta ER nisqapi. Clasepa hinaspa clasificación nisqapa hipotético ruwaynin. Chaymanta, ñawpaqtaqa C26 Gas1-GFPpa atiynintam GhLag1pi clústeres nisqapi huñukunanpaq estudiarqayku, huk alelo mutante temperatura-sensible sec31-1 nisqawan microscopía de fluorescencia convencional nisqawan, maypichus chay largo (C18-C16) cadena nisqallam kan ER membrana Ceramida nisqapi (Fig. 3). Qawarqaniku sec31-1 nisqapi, aswan achka Gas1-GFP nisqa clusterkunapi huñusqa kasqanmanta, chaymanta Gas1-GFP sec31-1 GhLag1 nisqapi largo (C18-C16) largo ceramida ER membranayuq kasqanmanta aswantaqa mana agrupasqa kasqanmanta hinaspa In the entere ER membrana nisqapi rakisqa kasqanmanta. Chiqap kananpaq, imaraykuchus C26 ceramida-based clustering nisqa ERES específico nisqawan anchata tupachisqa kachkan (1 kaq siqi), chaymantam investigarqaniku sichus kay ruwayqa ER exportación mecanismo nisqapa ruwaynintapas involucranmanchu. GPI-AP huk sistema especial COPII kaqwan ER exportación kaqpaq llamk’achin, kaytaq activamente regulado kachkan kay Ted1′s remodelación estructural kaqwan kay porción glicano kaqmanta kay ancla GPI kaqmanta ( 30 , 31 ). Chaymanta kay recombinante GPI-glicano riqsisqa kay transmembrana carga receptor p24 complejo kaqwan, kaytaq kutinpi selectivamente recluta Lst1 kaqwan, kaytaq huk isoforma específica kay hatun COPII cargaman hukllana subunidad Sec24 kaqmanta, huk GPI-AP-qhapaq COPII kaqwan ruwaspa Vesículas necesario kanku ( 31-33 ). Chayrayku, ruwarqayku huk iskay mutante kaqta kay sapalla proteínas (kay componente complejo p24 Emp24, kay GPI-glicano remodelación enzima Ted1 chanta kay específica COPII subunidad Lst1) kay sec31-1 mutante cepa kaqwan, chanta kayta estudiarqayku ¿Atikunmanchu Gas1-cluster GFP ruwayta (3 kaq siq’i). Qawarqaniku kay sec31-1emp24Δ kaqpi chaymanta sec31-1ted1Δ kaqpi, Gas1-GFP aswanta mana qutuchasqa kaqta chanta tukuy ER membrana kaqpi rakisqa kaqta, ñawpaq rikusqa hina sec31-1 GhLag1 kaqpi, sec31-1lst1Δ kaqpitaq, Gas1-GFP sec31-1 hina. Kay ruwakuykuna rikuchinku kay ceramida C26 kaqpa kayninmanta aswanta kay membrana ER kaqpi, kay agrupamiento kay Gas1-GFP kaqmantaqa kay complejo p24 kaqman hukllanakunan tiyan, chanta mana reclutamiento específico Lst1 kaqmanta necesitanchu. Chaymanta, explorarqayku kay atiyta kay cadena largo kay ceramida kay ER membrana kaqpi kay Gas1-GFP kay p24 kaqman hukllanakuyninta kamachiyta atin. Ichaqa, tarirqayku kay C18-C16 ceramida kaqpa kaynin kay membrana kaqpi mana afectanchu kay GPI-glicanos kaqmanta ruwasqa kay p24 complejo kaqwan (S3 chanta S4, A chanta B siqikuna) utaq kay GPI-AP kaqman hukllanakuy chanta kay GPI-AP hawa llaqtakunaman apachiq. yachay. Reclutamiento COPII subtipo Lst1 (S4C siqi). Chayrayku, C26 ceramidamanta dependiente agrupación mana necesitanchu interacciones proteicas kaqta hukniray ER exportación proteína mecanismos kaqwan, ichaqa yanapan huk mecanismo alternativo clasificación kaqta impulsado kay lipídicos largo kaqwan. Chaymanta, analizarqayku sichus kay ceramida acil cadena largo kay membrana ER kaqpi importante kanman kay efectiva clasificación Gas1-GFP kaqpaq kay selectivo ERES hina. Imaraykuchus Gas1 kay GhLag1 cepapi kay ceramida corta cadena kaqwan ERmanta lluqsispa kay membrana plasmática kaqman yaykun (S5 siqi), creeyku sichus kay clasificación kay ceramida acil cadena kaqpa largonwan purichisqa kanman chayqa, kay Gas1 kay GhLag1 cepa kaqpi kay redirigisqa kanman chanta chimpachisqa kanman. ERES nisqa qhatukuna kikin membranayuq.
(A) Kay membrana celular GhLag1 kaqmanta aswanta aswan pisi C18-C16 ceramidas kaqwan kachkan, chaymanta kay ancla GPI kay Gas1-GFP kaqmanta kay kikin C26 IPC kaqwanraq kachkan kay sallqa células kaqwan. Hawa: análisis de cadena acil nisqa ceramida nisqapa membrana celular nisqapi sallqa (Wt) hinaspa GhLag1p cepas nisqapa espectrometría de masas (MS) nisqawan. Chay willakuykunaqa pachakmanta hukninmi llapan ceramida nisqamanta. Kimsa sapanchasqa experimentokuna promedio nisqa. Pantasqa barra = SD. Iskay chupayuq mana parisqa t prueba. **** P <0.0001. Panel urapi: Análisis MS nisqa chay IPC nisqapa cadena acil nisqapa largonmanta, chaymi kachkan Gas1-GFP (GPI-IPC) GPI ancla nisqapi expresasqa chay cepas de tipo salvaje nisqapi chaynallataq GhLag1p nisqapipas. Chay willakuykunaqa pachakmanta hukninmi llapan IPC señalmanta. Pichqa sapanchasqa experimentokunamanta promedio. Pantasqa barra = SD. Iskay chupayuq mana parisqa t prueba. ns, mana importantechu. P = 0,9134 nisqa. (B) Micrografías de fluorescencia kay sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ chaymanta sec31-1lst1Δ células expresaq galactosa-inducida Gas1-GFP kaqmanta incubasqa karqanku 37°C kaqpi 30 minutos chaymanta pasarqanku urayman Perform microscopía rutinaria de fluorescencia chaymanta 24°C nisqapi. Yuraq flecha: ER Gas1-GFP qutu. Flecha kichasqa: Mana agrupado Gas1-GFP nisqa tukuy membrana ER nisqapi rakisqa kachkan, chaymi qawachin ER característico tinción anillo nuclear nisqa. Escala barra, 5μm. (C) (B) nisqapi willasqa fotomicrografía nisqapa cuantificacionnin. Chay promedio pachakmanta huknin células nisqakuna punctado Gas1-GFP estructurayuq. Kimsa sapanchasqa experimentokunapi, n≥300 células. Pantasqa barra = SD. Iskay chupayuq mana parisqa t prueba. **** P <0.0001.
Kay sasachakuy chiqanmanta allichanapaq, ruwarqayku SCLIM rikuchiyta Gas1-GFP kaqmanta chaymanta Mid2-iRFP kaqmanta GhLag1 kaqpi kay sec31-1 temperatura-sensible alelo mutante kaqwan ( Figura 4 chaymanta Película S4 ). Chay ER 37°C nisqapi waqaychasqa kaptin, chaymanta 24°C nisqapi kacharisqa kaptin, aswan achka musuq sintetizasqa Gas1-GFP nisqa mana agrupasqachu karqa, chaymanta tukuy ER membrana nisqapi rakisqa karqa, microscopios convencionales nisqawan qawasqanchikman hina (4, A hinaspa B siqi). Hinallatahmi, ERESpa hatun pachakmanta (67%) iskay laya cargakuna chaypi kuska tiyah (4D siqi). Paneles 1 y 2 nisqa Figura 4C nisqapim qawarikun iskay ejemplos típicos de ERES nisqawan Gas1-GFPwan Mid2-GFPwan superpuestos nisqawan. Hinallatahmi, iskaynin mercancías nisqakunam reclutasqa karqaku kikin ERES nisqaman (Figura 4E, panel 3 y película S4). Chayrayku, ñuqaykupa ruwasqaykuqa qawarichinmi chay cadena acil ceramida nisqapa largon membrana ER nisqapi huk importante determinante kasqanmanta agregación proteica ER nisqamanta hinaspa clasificación nisqamanta.
Sec31-1 GhLag1 células expresaq galactosawan inducida secreciones, Gas1-GFP (GPI-AP, verde) chaymanta Mid2-iRFP (TMP, azul) chaymanta constitutiva ERES-etiquetado Sec13-mCherry (ERES, magenta) Incuban 37°C. 30 minutukunata hinalla ruwana, 24°C nisqaman uraykachiy secreciones nisqakunata kacharinanpaq, hinaspa 20 minutomanta SCLIM nisqawan imahinata ruwana. (Amanta Ckama) Representante 2D proyección siq’ikuna (A; barra de escala, 1μm) utaq 3D celular hemisferio siq’ikuna (B y C; unidad de escala, 0,45μm) chay 10 z-secciones nisqamanta cargawan ERESwan marcasqa. (B) kaqpi uray panel chaymanta (C) kaqpi panel procesado siq'ikunata rikuchinku ERES (magenta) kaqpi kaq bienesllata rikuchinapaq [Gas1-GFP (gris) chaymanta Mid2-iRFP (azul k'anchay)]. (C) Yuraq huntasqa flecha: ERES, bienes superpuestos. Kichasqa flecha: ERES nisqapiqa hukllam kachkan. Uray panel: Akllasqa ERES nisqapiqa (1 y 2) (C) nisqapi marcasqa mercancías superpuestas nisqayuqmi. Barra de escala, 100 nm. (D) (C) nisqapi willasqa fotomicrografía nisqapa cuantificacionnin. Chay unidades sec31-1 y sec31-1 GhLag1 nisqapiqa huk cargallam (Gas1-GFP utaq Mid2-iRFP) churasqa kachkan, chaynallataqmi sapa pachakmanta huknin ERES nisqapas carga aislada nisqapaq chaynallataq carga superpuesta nisqapaqpas. Kimsa sapanchasqa experimentokunapi, n = 432 54 células nisqapi (sec31-1) chaymanta n = 430 47 células nisqapi (sec31-1 GhLag1). Pantasqa barra = SD. Iskay chupayuq mana parisqa t prueba. *** P = 0,0002 (sec31-1) y ** P = 0,0031 (sec31-1 GhLag1) nisqa. (E) 3D siq’i akllasqa ERES nisqamanta carga superpuesto (3) nisqawan (C) nisqapi marcasqa. Gas1-GFP (verde) chaymanta Mid2-iRFP (azul) kaqlla ladomanta ERES (magenta) nisqaman asuykunku, kikin ERES restringido nisqapi qhipakunku. Barra de escala, 100 nm.
Kay yachayqa prueba directa in vivo kaqpi qun kay cargas proteicas basadas en lípidos kaqpi clasificasqa kanku kay sitios de exportación selectiva kaqpi kay secretora ñanpi, chanta rikuchin kay importancia kay cadena acil largo kaqmanta kay selectividad clasificación kaqpaq. Huk kallpasapa chaymanta punta punta microscopía técnica SCLIM sutiyuqta llamk’achispa, rikuchirqayku musuq sintetizado Gas1-GFP (huk hatun membrana plasmática GPI-AP huk ancha suni cadena acil (C26) ceramida lípido porción kaqwan) levadurapi ) Chay regiones agrupadas en discretos ERs nisqakunam hukllawasqa kachkanku ERES específico nisqawan, chaynallataqmi transmembrana secretada proteínas nisqakuna rakisqa kachkanku tukuy membrana ER nisqapi (1 kaq siqi). Hinaspapas, kay iskay laya bienes nisqakunan akllaspa hukniray ERES nisqaman haykunku (2 yupay). Chay ceramida celularpa cadena acilpa largonmi membranapi pisiyachisqa C26manta C18-C16kama, chay clúster Gas1-GFP nisqapas discreta ER región nisqamanmi sasachakun, chaymantam Gas1-GFP nisqapas huk ñanman churasqa kachkan chay ER nisqamanta lluqsinanpaq chay proteína transmembrana nisqawan chay kikin ERES nisqawan (3 yupay hinaspa 3 siqi). 4).
Aunque GPI-AP huk mecanismo proteico especializado ERmanta lluqsinanpaq llamk’achin, tarirqayku kay C26 ceramidamanta dependiente t’aqakuy mana interacciones proteicas diferenciales kaqpi hapipakusqanmanta mayqinkunachus ERES especialización kaqman apayta atinku ( Figuras S4 chanta S5 ). Aswanpas, tarisqaykuqa huk mecanismo de clasificación alternativo nisqatam yanapan, chaymi puririchisqa kachkan agrupamiento proteico basado en lípidos nisqawan chaymanta huk cargakuna qipaman exclusión nisqawan. Kay qhawayniykuqa rikuchin kay Gas1-GFP región utaq clúster asociado huk específico ERES kaqwan faltan kay transmembrana secretada proteína Mid2-iRFP kaqwan, kaytaq rikuchin kay C26 ceramida-dependiente GPI-AP cluster facilitanqa kay ERES relevante kaqman yaykuyninkuta, chanta kikin pachapi, excluye transmembrana Kay secreciones kay particular ERES kaqman yaykunku (Figuras 1 y 2). Kay contraste kaqpi, kay C18-C16 ceramidas kaqkuna kay membrana ER kaqpi mana kay GPI-AP kaqta ruwanchu kay regiones utaq clústeres kaqta, chayrayku mana excluyenkuchu nitaq sustituyenkuchu kay proteínas secretadas transmembrana kaqmanta kay kikin ERES kaqman (Figuras 3 y 4). . Chayrayku, proponeyku kay C26 ceramida t’aqakuyta chanta clasificación kaqta purichin kay agrupación de proteínas kaqta ERES específico kaqwan tinkisqa kaqta yanapaspa.
¿Imaynatataq kay C26 ceramidamanta dependiente agrupamientota huk específica área ER nisqaman chayana? Kay tendencia kay ceramida de membrana kaqmanta t’aqakuypaq lateralmente ruwanman kay GPI-AP chanta kay C26 ceramida kaqmanta kay juch’uy chanta huk ratolla ordenasqa lípidos kaqta ruwanankupaq kay aswan irregular lípidos muyuriqpi kay membrana ER kaqmanta mayqinchus aswan pisi chanta mana saturado glicerolípidos kaqwan kachkan. Clusteres de calidad nisqa (17, 18). Kay huch’uy racimo temporal kaqkunaqa aswanta fusionasqa kankuman aswan hatun, aswan takyasqa clústeres kaqkunaman kay complejo p24 kaqman hukllanakusqankumanta ( 34 ). Kaywan kuska, rikuchirqayku C26 Gas1-GFP p24 complejowan tinkuchiyta necesitan aswan hatun rikukuq qutukunata ruwananpaq (3 yupay). Kay p24 complejo huk heterocigómero oligómero tawa hukniray p24 transmembrana proteínas kaqmanta ruwasqa levadura kaqpi ( 35 ), kaytaq qun multivalente hukllanakuyman, kaytaq apayta atin kay reticulación kaqman kay juch’uy GPI-AP clústeres kaqmanta, chaywantaq aswan hatun clúster Estable kaqmanta paqarichimun ( 34 ). Kay interacción kay ectodominios proteicos kaqwan kay GPI-APs kaqmanta yanapakunmantaq kay agregaciónninkupi, kay rikuchikun kay Golgi transporte kaqninkupi kay células epiteliales polarizadas mamaliares kaqpi ( 36 ). Ichaqa, C18-C16 ceramida ER membrana kaqpi kaptin, kay p24 complejo Gas1-GFP kaqman hukllawakuptin, hatun sapaq qutukuna mana ruwakunqachu. Chay mecanismo subyacenteqa kanmanmi chay ceramida de cadena acil larga nisqapa propiedades físicas y químicas específicas nisqamanta. Estudios biofísicos nisqakuna membranas artificiales nisqamanta qawarichinku, iskaynin ceramidas de cadena acil largo (C24) hinallataq corto (C18-C16) nisqakuna fase rakiyta ruwayta atinkuman chaypas, ceramidas de cadena acil suni (C24) nisqakunallam hatun Curvatura nisqatapas, película flexión nisqatapas kallpanchanmanku, chaynapi película nisqa musuqmanta formakunanpaq. Referencia mutual nisqawan (17, 37, 38). Kayta rikuchikurqa kay hélice transmembrana kay TMED2 kaqmanta, kay homólogo humano kaqmanta kay Emp24 kaqmanta, kay C18 ceramida kaqpi ruwasqa esfingomielina kaqwan kay lóbulos citoplasmáticos kaqpi akllaspa interactúan ( 39 ). Simulaciones de dinámica molecular (MD) nisqawanmi tarirqayku iskaynin ceramidas C18 hinallataq C26 nisqakuna huñukusqankuta chay lóbulos citoplasmáticos nisqapa muyuriqninpi Emp24 transmembrana hélice nisqapi, chaymantapas chayna munasqankum kanku (S6 siqi). Kayqa allinmi qawarinapaq kayqa qawarichinmi Emp24pa hélice transmembrana nisqa membranapi lípidos nisqapa distribución asimétrica nisqaman apayta atisqanmanta. Kayqa chayllaraqmi ñuñuq animalkunapa célulankunapi ruwasqa. Chayman rikchakuq simulaciones MD nisqapas qawarichinmi lípidos éter nisqapa kayninta (40) . Chayrayku, suyayku kay C26 ceramida kay iskay lóbulos kaqpi kay ER26 kaqpi kay localmente qhapaqyachisqa kaqta. Maypachachus GPI-AP kay lóbulos luminales kaqpi chiqanmanta kay p24 multivalente kaqman hukllakun chanta kay acumulación kay C26 ceramida kaqmanta kay p24 muyuriqpi kay lóbulos citoplasmáticos kaqpi, kayqa kay acompañante agregación de Proteínas chanta kay curvatura de membrana kaqta kay dedos kaqnintakama ruwakunman ( 41 ), kaytaq kay GPI-AP t’aqakun kay discretas regiones kaqman kay ERES kaqwan ladomanta, kaytaq favorecen kay altamente curvadas kaqman regiones de la membrana ER nisqamanta (42). Ñawpaq willakuykunaqa yanaparqakum chay mecanismo propuesto nisqataqa (43, 44). Kay multivalente hukllanakuy kay oligolectinas kaqmanta, kay patógenos kaqmanta utaq kay anticuerpos kaqmanta kay ceramida kaqpi ruwasqa glicosfingolípidos (GSL) kaqman kay membrana plasmática kaqpi hatun GSL huñuyta qallarichin, kay fase t’aqakuyta kallpachan chanta kay membrana deformación chanta internalización kaqta ruwan ( 44 ). Iwabuchi etc. (43) Tarikurqa kay largo (C24) ichaqa mana pisi (C16) cadenas acil kaptin, kay ligando multivalente GSL lactosilceramidaman watasqa hatun clústeres nisqakuna ruwakunanpaq chaymanta invaginación de membrana nisqapi, chaymanta kay citoplasma Lyn-mediada señal transducción kay folletos kaqpi interdigitado kaqta kay cadenas acílicas kaqwan kuskachasqa neutrófilos nisqakuna.
Kay mamaliamanta células epiteliales polarizadas kaqpi, kay concentración kay anti-Golgi llika (TGN) kaqmanta kay nivel kay membrana plasmática apical kaqman controlan kay t’aqakuy chanta kay clasificación kay GPI-AP kaqmanta ( 10 , 45 ). Kay huñunakuyqa GPI-AP oligomerización kaqwan purichisqa ( 36 ), ichaqa kay ceramida cadena largomanta levadurapi tarisqanchikmantapas dependenman. Mamífero GPI-AP huk ancla lípido éter kaqpi ruwasqa kaptinpas, chaymanta estructura química nisqa ancha hukniraq kachkan kay ancha suni cadena acil ceramida kaqmanta, huk kunanlla yachay tarisqa kay iskaynin lípidos evolutivamente kaqlla propiedades físicas chanta químicas kaqwan chanta ruwayniyuq kasqankuta (40). Chayrayku, kay parte lípido éter kaqmanta kay células mamíferas kaqpi kay ceramida C26 kaqman rikch’akunman kay levadura kaqpi, chanta kay ruwayninqa kay ceramida largo cadena kaqwan kay membrana kaqpi hukllanakuynin kay GPI-AP huñukuyninta chanta t’aqayta kallpachananpaq. Kay atiyqa chiqapmanta pruebasqa kananraq kaptinpas, ñawpaq tarikuykunam yanapan chay ceramida de larga cadena acil nisqapa Golgi kurkuman apachiyninqa manam proteínas de transferencia citoplasmática nisqawanchu ruwakun, aswanqa levadura hina anclaje GPI nisqapa sintesisninmantam kanqa. Chayrayku, kay mecanismo conservador evolutivoqa atikunman hina selectivamente co-transportar ancha largo cadena acil ceramida kaqwan GPI-AP kaqwan (13, 16, 20, 46, 47) kikin vesícula transporte kaqpi.
Levadura kaqpi chanta kay mamario polarizado sistemas celulares epiteliales kaqpi, kay GPI-AP agregación chanta t’aqakuy wak proteínas kay membrana plasmática kaqmanta tukuyninku ruwakunku manaraq kay células hawaman chayachkaspa. Paladino y al. (48) tarirqanku kay TGN kaqpi kay células epiteliales polarizadas mamíferas kaqpi, kay GPI-AP agrupamiento mana necesariochu kay clasificación selectiva kay GPI-APs kaqmanta kay membrana plasmática apical kaqman, aswanpis kay organizacion agrupación kaqmanta kay GPI-APs kaqmanta chanta kay actividad biológica Sumanta ima kamachin. Célula hawan. Levadura kaqpi, kay yachayqa rikuchirqa kay C26 ceramidamanta dependiente GPI-AP cluster kay ER kaqpi kay cluster organizacionta chanta kay actividad funcional kay GPI-AP kaqmanta kay membrana plasmática kaqpi kamachiyta atin ( 24 , 49 ). Kay modelowan tupaq, GhLag1 células kaqkunaqa alergiayuq kanku kay inhibidores GPI kaqman utaq hampikunaman mayqinkunachus afectan kay integridad celular pirqaman ( 28 ), chanta kay necesidad kay clústeres funcionales Gas1-GFP kaqmanta ( 49 ) kay ceramida punta kaqmanta proyectada kay apareamiento kay células levaduras kaqpi rikuchin kay G Posibles consecuencias fisiológicas kay hLag1 células kaqmanta. GPI-AP pantasqa. Ichaqa, aswan prueba ruway sichus kay organizacion funcional kay célula hawanmanta programasqa kachkan kay ER kaqmanta huk método de clasificación kaqwan kay lípidos largo kaqpi hapipakuspa kay hamuq investigacionniykumanta kanqa.
Kay llamkaypiqa Saccharomyces cerevisiae nisqa cepas nisqakunam churasqa kachkanku Cuadro S1 nisqapi. Kay MMY1583 chaymanta MMY1635 cepas kay SCLIM kaqmanta kay kawsaq células imajinas kaqpaq ruwasqa karqa kay W303 kaqpa qhipanpi. Kay cepas expresaq Sec13-mCherry huk etiqueta proteica fluorescente kaqwan ruwasqa karqanku huk método basado en reacción en cadena de polimerasa (PCR) kaqwan kay plásmido pFA6a kaqwan huk plantilla hina ( 23 ). Kay cepa expresaq Mid2-iRFP etiquetada kay proteína fluorescente kaqwan kay GAL1 promotorpa controlninpi ruwasqa karqa kayhinata. PCR amplificación kay iRFP-KanMx secuenciamanta kay pKTiRFP-KAN vectormanta (regalo kay E. O’Sheamanta, Addgene plásmido yupay 64687; http://n2t.net/addgene: 64687; investigación recurso identificador (RRID): Addgene_64687) Hinallataq churasqa kay C-terminal kaqpi kay endógeno Mid2 kaqmanta. Kay Mid2-iRFP genoma secuencia amplificasqa kaptin chaymanta kay GAL1 promotorman clonasqa kaptin, kay Not I-Sac I sitioman hukllawakurqa kay integración plásmido pRS306 kaqpi. Kay plásmido pRGS7 ruwasqa kaqta linealizado karqa kay Pst I kaqwan kay URA3 locus kaqman hukllawakunanpaq.
Kay Gas1-GFP fusión gen kaqqa kay GAL1 promotorpa kamachiyninpi kay centromero (CEN) plásmido kaqpi expresakun, kaytaq kayhinata ruwasqa. Kay Gas1-GFP secuenciaqa amplificasqa karqa PCR kaqwan kay pRS416-GAS1-GFP plásmidomanta (24) (regalo de L. Popolo) chaymanta clonasqa karqa kay Xma I–Xho I sitiopi kay plásmido CEN pBEVY-GL LEU2 (regalo de C) . Miller sutiyuq runa; Addgene plásmido yupay 51225; http://n2t.net/addgene: 51225 nisqapi; RRID: Yanapakuy_51225). Chay plásmido lluqsisqataqa pRGS6 sutiyuqmi karqa. Kay Axl2-GFP fusión gen kaqtapas expresakun kay control kaqpi kay GAL1 promotor kay pBEVY-GL LEU2 vector kaqmanta, chanta kay ruwayninqa kayhina. Kay Axl2-GFP secuenciaqa pRS304-p2HSE-Axl2-GFP plásmidomanta (23) PCR kaqwan amplificasqa karqa, chanta clonasqa karqa kay Bam HI-Pst I sitiopi kay pBEVY-GL LEU2 vector kaqpi. Chay plásmido lluqsisqataqa pRGS12 nispa suticharqanku. Kay yachaypi llamk’achisqa oligonucleótidos nisqapa secuencianmi Tabla S2 nisqapi churasqa kachkan.
Chay cepaqa 0,2% adeninawan 2% glucosawan [YP-dextrosa (YPD)], 2% rafinosa [YP-raffinosa] riqueza levadura extracto proteína p (YP) mediowan (1 % Levadura extractowan 2% proteína ept)wan yapasqa karqa. (YPR)] utaq 2% galactosa [YP-galactosa (YPG)] carbono fuente hina, utaq sintético mínimo medio nisqapi (0,15% levadura nitrógeno base hinaspa 0,5% sulfato de amonio) allin aminoácidos nisqakunata hinaspa bases nisqakunata yapanapaq, nutrición nisqapaq necesitasqankuta , Hinallataq 2% glucosa nisqayuq (medio mínimo glucosa sintética nisqa) utaq 2% galactosa nisqayuq (sintético galactosa mínima medio) nisqa karbunpa paqariynin hina.
Chiqap pacha imajinaspaq, temperatura-sensibles sec31-1 mutantes células expresaq kay constructota kay GAL1 promotorpa uranpi wiñachisqa karqa kay YPR mediopi 24°C huk tutamanta chawpi log fasekama. YPG nisqapi 24°C nisqapi 1 hora inducción nisqamanta, células nisqakunatam SG nisqapi 37°C nisqapi 30 minuto incubarqunku, chaymantam 24°C nisqaman aparqaku bloque de secreción nisqamanta kacharinankupaq. Concanavalina A nisqawanmi células nisqakuna diapositiva de vidrio nisqapi allichasqa karqa, chaymantam SCLIM nisqawan imahina ruwasqa karqa. SCLIM nisqaqa Olympus IX-71 microscopio fluorescencia invertida nisqawan UPlanSApo 100×1.4 apertura numérica nisqa aceite nisqawan (Olympus), hatun rit'iyuq chaymanta hatun señal-ruyru ratio muyuriq disco confocal escáner (Yokogawa Electric), espectrómetro personalizado, chaymanta costumbre q'uñichiy Sistema nisqap siq'i kallpachaqnin (Hamamatsu) nisqap hukllanakuyninmi Fotonica) nisqa hatunyachiq sistemata quyta atin, ×266,7 tukukuy hatunyachiywan, chaymanta carga-coupled dispositivo cámara nisqawan, chaymi electronkunata mirachin (Hamamatsu Photonics) (21). Imahinakuna hapiyqa ruwasqa software (Yokogawa Electric) nisqawanmi. 3D siq’ikunapaq, huk actuador piezoeléctrico ruwasqa ruwasqaykuwan llamk’achirqayku, chaywantaq lente objetiva nisqa sayaqpi kuyuchirqayku, chaymantataq 100 nm t’aqasqa óptico nisqa partekunata pilapi huñurqayku. Z-pila siq'iqa 3D voxel willaykunaman tikrasqa, chaymanta teórico punto mastariy ruway microscopio confocal disco muyuriqpaq llamk'achisqa, Volocity software (PerkinElmer) kaqwan desconvolución ruwanapaq llamk'achisqa. Volocity software nisqawanmi kikinmanta umbral nisqaman chayananpaq análisis de co-locación nisqapaq, ERES nisqa carga nisqawan kuska tupusqa. Análisis de escaneo de línea nisqa ruwakurqa software MetaMorph (Dispositivos Moleculares) nisqawan.
GraphPad Prism software nisqawan yanapachikuy, chaywanmi yachanki significación estadística nisqa. Iskay chupayuq Student’s t-pruebapaq chaymanta ordinario huk ñanniyuq anlisis de varianza (ANOVA) pruebapaq, qutukunapura chiqan kayninkuqa, P <0.05 (*) nisqapi ancha allinta qhawarikun.
Microscopía de fluorescencia Gas1-GFP nisqamanta, células de fase log nisqakunatam huk tuta YPD nisqapi wiñachirqaku hinaspam centrifugación nisqawan huñurqaku, iskay kutita mayllarqaku salina tamponada fosfato nisqawan, hinaspam hielopi 15 minutollapas incubarqunku, chaymantam microscopio nisqawan ruwarqaku ñawpaqpi willakusqanman hina Check (24). Chay rantikunapaqmi Leica DMi8 microscopio (HCX PL APO 1003/1.40 aceite PH3 CS) nisqawan equipasqa karqa, chaymi equipasqa karqa lente objetiva nisqawan, filtro L5 (GFP) nisqawan, cámara Hamamatsu nisqawan hinaspa Software Application Suite X (LAS X) nisqawan. .
Chay muestrakunatam desnaturalizarqaku tampón de muestra SDS nisqawan 65°C nisqapi 10 minuto, chaymantam rakirqaku electroforesis de gel SDS-poliacrilamida (PAGE) nisqawan. Análisis inmunoblotting nisqapaqqa, 10 μl muestratam sapa carrilpi cargarqaku. Anticuerpo primario: Conejo policlonal anti-Gas1 dilución 1:3000 kaqpi, conejo policlonal anti-Emp24 1:500 dilución kaqpi, conejo policlonal anti-GFP (H. Riezmanmanta huk regalo) 1:3000 dilución kaqpi. Kay anticuerpo monoclonal anti-Pgk1 de rata kaqmanta llamk’achikurqa huk dilución kaqpi 1:5000 kaqpi (huk regalo J. de la Cruz kaqmanta). Anticuerpo secundario: Peroxidasa de rábano (HRP) nisqawan conjugada cabra anti-conejo inmunoglobulina G (IgG) nisqawan, 1:3000 dilución nisqapi llamk’achisqa (Pierce). HRP-conjugado cabra anti-rata IgG llamk’achikurqa huk dilución 1:3000 (Pierce). Kay zona inmune kutichiyqa qhawasqa karqa kay método quimiluminescencia kaqwan kay reactivo SuperSignal West Pico (Thermo Fisher Scientific) kaqwan.
Imaynatachus (31) kaqpi willasqa, huk experimento inmunoprecipitación natural ruwakurqa kay fracción ER enriquecida kaqpi. Pisi rimayllapi, levadura células nisqakunata mayllana TNE tampón nisqawan [50 mM tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM flúor de fenilmetilsulfonilo nisqawan chaymanta inhibidor proteasa nisqawan chaqrusqawan) 600 nm ( OD600) nisqapi 100 densidad óptica nisqapi iskay kutita. Chaytaqa vidriomanta perlaswanmi pakirqaku, chaymantam centrifugacionwan celulakunapa runtuchankunatawan vidriomanta perlaskunata hurqurqaku. Chaymantaqa chay hawa yakuta centrifugarqaku 17.000 g nisqapi 15 minuto 4°C nisqapi. Chay pellet nisqatam TNE nisqapi musuqmanta suspendirqaku hinaspam digitalis saponina nisqatapas yaparqaku 1% nisqa tukupay concentración nisqaman. Chay suspensión nisqatam 1 horata 4°C nisqapi muyuchispa incubarqunku, chaymantam mana chulluq componentekunata hurqurqaku centrifugacionwan 13.000 g 4°C nisqapi 60 minuto. Gas1-GFP inmunoprecipitación nisqapaqqa, ñawpaqtaqa muestrataqa ch’usaq agarosa perlaswan (ChromoTek) 4°C nisqapi 1 horata ñawpaqta incubarana, chaymantataq GFP-Trap_A (ChromoTek) nisqawan 4°C nisqapi 3 horata incubarana. Chay inmunoprecipitado perlas nisqakunatam pichqa kutita mayllarqaku TNE nisqawan, chaypim 0,2% digoxigenina nisqa karqa, chaymantam eluido karqa tampón de muestra SDS nisqawan, chaymantam SDS-PAGE nisqapi rakisqa karqa, chaymantam inmunoblotting nisqawan analizasqa karqa.
Imaynatachus (31) nisqapi willakurqa, determinación de reticulación nisqa ruwakurqa chay fracción ER enriquecida nisqapi. Pisi rimayllapi, chay fracción ER qhapaqyachisqaqa 0,5 mM ditiobis(succinimidil propionato) nisqawanmi incubasqa karqa (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, EE.UU.; 20°C, 20 min). Chay reacción de reticulación nisqataqa wañuchirqakum glicina nisqa yapaspa (50 mM concentración final, 5 minutos, 20°C).
Ñawpaqta willasqa hina (50), análisis MS ceramidamanta ruwakurqa sallqa-tipo hinallataq GhLag1 cepaskunapi. Pisi rimayllapi, células nisqakunatam wiñachirqaku fase exponencial nisqaman (3manta 4 OD600 unidades/ml) YPD nisqapi 30°C nisqapi, chaymantam 25×107 células nisqakunata pallarqaku. Paykunapa metabolismonqa ácido tricloroacético nisqawanmi wañuchisqa. Disolvente extracción [etanol, yaku, éter, piridina chaymanta 4,2 N hidróxido de amonio (15:15:5:1:0,018 v/v)] chaymanta 1,2 nmol ceramida C17 estándar interna (860517, lípido polar Avanti) calidad) nisqawan yanapachikuy. Reactivo monometilamina nisqawan [metanol, yaku, n-butanol y solución de metilamina (4:3:1:5 v/v)] nisqawanmi chay extracto nisqamanta llamp’u hidrólisis alcalina nisqa ruwakun, chaymantataq n-butanol nisqawan yakuwan saturado nisqawan kachita hurquna. Tukuyninpiqa, chay extracto nisqatam yapamanta suspendirqaku disolvente de modo positivo nisqapi [cloroformo/metanol/yaku (2:7:1) + 5 mM acetato de amonio] nisqapi hinaspam inyectarqaku espectrómetro de masas nisqaman. Multi-reacción monitoreo (MRM) ruwakurqa kay identificación chaymanta cuantificación kay moléculas esfingolípidas kaqmanta. Chay TSQ Vantage terciario cuadrupolo espectrómetro de masas (Thermo Fisher Scientific) nisqaqa huk robotico nanoflujo iones fuente Nanomate HD (Advion Biosciences, Ithaca, NY) nisqawanmi equipasqa kachkan, chaywanmi lipídico nisqa anlisis ruwakun. Chay tupanakuy kallpaqa sapa ceramida categoría nisqapaqmi allinchasqa kachkan. MS nisqamanta willakuykunaqa modo positivo nisqapim hurqusqa karqa. Sapa biológico replicado kaqpaq, kay señal lipídica kaqmantaqa kimsa sapanchasqa tupuykunamanta mediana kaq.
Imaynatachus (31) willakurqa, kay células (800×107) expresaq Gas1-GFP kaqta inmunoprecipitación natural kaqman churakurqa. Chay chuyanchasqa Gas1-GFP nisqatam SDS-PAGE nisqawan rakirqaku hinaspam fluoruro de polivinilideno (PVDF) nisqaman aparqaku. Chay proteína nisqatam qawarichirqaku PVDF nisqataqa amida yanawan tintaspanku. Chay Gas1-GFP bandaqa PVDFmanta kuchusqa, 5 kutita metanolwan mayllasqa, huk kutitaq cromatografía líquida-MS (LC-MS) grado yakuwan. Chay membrana tirata 500μl 0,3 M NaOAc (pH 4,0), tampónwan 500μl chayraq chullusqa 1 M nitrito sódico chaqrusqawan 37°Cpi 3 horata incubaspa, chay fracción lípida nisqa Gas1-GFPmanta lluqsimun hinaspa lisis Release de inosina fosfato ceramida entre glucosamina y inositol (51). Chay qhipamanmi, chay membrana tirataqa tawa kutita mayllarqaku LC-MS grado yakuwan, chaymantam temperatura ambiente nisqapi chakichirqaku, hinaspam waqaycharqaku nitrógeno nisqa atmósfera nisqapi -80°C nisqapi anlisis nisqakama. Control hinaqa, sapa experimentopaqmi huk muestra ch’usaq membrana PVDF nisqamanta ruwakurqa. Chaymantaqa Gas1-GFPmanta hurqusqa lípido nisqatam MS nisqawan qawarirqaku imaynam willakusqanman hina ( 50 ). Pisi rimayllapi, PVDF tiras GPI-lípido nisqayuq kaqkunam 75μl negativo disolvente de molde nisqapi [cloroformo/metanol (1:2) + 5 mM acetato de amonio] nisqapi musuqmanta suspendisqa karqa, chaymantam ionización electrospray (ESI)-MRM/MS Análisis de especies de esfingolípidos (TSQ Vantage) nisqapi pasasqa. Kay casopiqa, MS nisqamanta willakuykunaqa modo iones negativos nisqapim tarikurqa.
Ñawpaqta nisqanchis hina, kay lipídico parte kay GPI ancla kaqmanta t’aqasqa karqa kay [3H]-inositol-etiquetado GPI-AP kaqmanta ( 16 ). Chay lípidos nisqakunatam rakirqaku cromatografía de capa fina nisqawan sistema disolvente nisqawan (55:45:10 cloroformo-metanol-0,25% KCl) hinaspam qawarichirqaku FLA-7000 (Fujifilm) nisqawan.
Gas1-GFP (600×107) expresaq células nisqakunatam iskay kutita mayllarqaku TNE tampónwan TNE tampón nisqawan, hinaspam vidriomanta perlaswan pakirqaku, chaymantam centrifugarqurqaku celularpa runtuchankunata hinaspa vidriomanta perlas nisqakunata hurqunankupaq. Chaymantaqa chay hawa yakuta centrifugarqunku 17.000 g nisqapi 1 horata 4°C nisqapi. Chay pellet nisqatam TNE nisqapi mayllarqaku hinaspam 1 U PI-PLC (Invitrogen) nisqawan TNE nisqapi 0,2% digitalis saponina nisqayuqpi 1 horata 37°C nisqapi incubarqunku. Chay enzima hampiymantaqa, chay membrana nisqatam hurqurqaku centrifugación nisqawan 17.000 g 4°C nisqapi 1 hora. Gas1-GFP inmunoprecipitanapaq, chay hawa yakuta GFP-Trap_A (ChromoTek) nisqawan 4°C nisqapi huk tuta incubarqunku. Chay ch’uyanchasqa Gas1-GFP t’aqasqa SDS-PAGE nisqawanmi Coomassie brillante azul nisqawan t’inkisqa karqan. Chay Gas1-GFP tinción bandaqa kuchusqa karqa grismanta muyuriqninpi yaku conductomanta, chaymanta alquilación yodoacetamidawan chaymanta reducción ditiotreitolwan, digestión in-gel tripsinawan ruwakurqa. Péptidos trípticos nisqakunata, péptidos nisqakunatapas GPI-glicanos nisqawan hurquspa ch’akichiy. Chay ch’akisqa péptido nisqatam 20 μl yakupi chulluchirqaku. Huk porción (8μl) LC nisqaman inyectana. Huk columna octadecilsilano (ODS) (Develosil 300ODS-HG-5; ukhu diámetro 150 mm×1.0 mm; Nomura Chemical, Aichi Prefectura, Japón) nisqawanmi péptidos nisqakuna t’aqasqa karqan, condiciones específicas de gradiente nisqapi. Fase móvil nisqa disolvente A (ácido fórmico 0,08%) disolvente B (ácido fórmico 0,15% 80% acetonitrilo nisqapi). Huk sistema Accela HPLC (Thermo Fisher Scientific, Boston, Massachusetts) nisqawanmi columnata disolvente A nisqawan 55 minutos ukupi 50 μl min-1 caudal nisqapi 5 minutos nisqapi eluykurqa, chaymantam disolvente B nisqapa concentración nisqa 40% nisqaman yapakurqa. , Hukllachasqa Amirika Suyukuna). Chay eluado nisqatam sapa kutilla churarqaku chay fuente de iones ESI nisqaman, chaymantam chay péptidos trípticos nisqakunata chaynallataq GPI-glicanos nisqayuq péptidos nisqakunatapas LTQ Orbitrap XL (espectrómetro de masas híbridos de trampa de iones lineales-orbitrap; Thermo Fisher Scientific) nisqawan qawarirqaku. Chay MS churaypiqa, chay fuente capilar nisqapa voltaje nisqa 4,5 kV nisqamanmi churasqa karqa, chaymantam capilar de transferencia nisqapa temperaturan 300°C nisqapi waqaychasqa karqa. Chay voltaje capilar nisqapas, voltaje de lente tubo nisqapas 15 V y 50 V nisqamanmi churasqa karqa. MS nisqamanta willakuyqa tarikurqa chay modo iones positivos nisqapi (resolución 60.000; exactitud de masa 10 partes por millon nisqapi) huk masa nisqapi 300/m/z masa/carga ratio (m/z) 3000. Chay MS/MS nisqamanta willakuykunaqa tarikunmi trampa iones nisqawan LTQ Orbitrap XL nisqapi [primero 3 dígitos nisqamanta mayqinkunamantachus datos dependen, disociación inducida de colisión (CID) nisqa].
Simulaciones MD nisqakunam ruwakurqa software GROMACS (52) nisqawan chaynallataq MARTINI 2 campo de fuerza nisqawan (53-55). Chaymantaqa CHARMM GUI Membrana Builder (56, 57) nisqawanmi ruwakurqa huk bicapa nisqa dioleoilfosfatidilcolina (DOPC) nisqawan Cer C18 nisqawan utaq DOPC nisqawan Cer C26 nisqawan. Cer C26pa topología nisqapas, coordenadas nisqapas DXCE nisqamanta hurqusqam, chay extra perlas nisqakunata esfingosina chupamanta hurquspa. Uraypi willasqa ruwayta llamk'achiy iskay qatata equilibranapaq chaymanta purichinapaq, chaymanta llamkanamanta qhipa coordenadas llamk'achiy huk sistemata ruwanapaq Emp24 kaqwan. Kay dominio transmembrana kay levadura Emp24 kaqmanta (residuos 173 kaqmanta 193 kaqkama) ruwasqa karqa huk α-hélice hina kay visual MD (VMD) herramienta estructura molecular kaqwan ( 58 ). Chaymantaqa, chay lípidos superpuestos nisqakunata hurquruspaqa, chay proteína nisqatam grueso granularqaku hinaspam bicapa nisqaman churarqaku CHARMM GUI nisqawan. Qhipa sistemaqa 1202 DOPC nisqawan 302 Cer C26 nisqawan utaq 1197 DOPC nisqawan 295 Cer C18 nisqawan Emp24 nisqawan ima kachkan. Chay sistemata ionizay 0,150M concentración nisqaman. Tawa independiente replicados ruwakurqa iskay bicapa composiciones nisqapaq.
Chay bicapa lípida nisqa equilibrasqa kan chay proceso CHARMM GUI nisqawan, chaymi 405.000 llamkaykunata pisiyachispa chaymanta equilibrar, chaypim posiciónpa harkakuyninkuna pisi pisimanta pisiyachisqa hinaspa chinkachisqa, chaynallataqmi pacha llamkayqa yapakun 0,005 psmanta 0,02 pskama. Equilibración ruwasqamantaqa 6 μs nisqatam paqarichimun 0,02 ps nisqa pacha llamkaywan. Emp24 churasqamanta, kikin CHARMM GUI ruwayta llamk'achiy sistemata pisiyachinapaq chaymanta equilibranapaq, chaymanta 8 s ruwaypi purichiy.
Llapan sistemakunapaqmi, equilibrio ruwaypiqa, chay presión nisqataqa barostato Berendsen (59) nisqawanmi kamachikun, chaymantatahmi chay presión nisqa barostato Parrinello-Rahman nisqawan (60) kamachikun. Tukuy imapiqa, chay promedio nisqa presión nisqa 1 bar nisqa, chaymi esquema de acoplamiento de presión semiisotrópica nisqawan yanapachikun. Chay equilibrio nisqapi, producción nisqapipas, termostato (61) nisqawanmi, recalibración de velocidad nisqawan, chaywanmi tupachikun chay temperatura de partículas proteicas, lípidas y disolventes nisqakuna. Tukuy llamkaypiqa, 310K ruphaymi. Chay mana hukllanakuy interacción nisqa yupasqa kachkan huk lista de parejas nisqa ruwaspa chay esquema Verlet nisqawan 0,005 tolerancia de tampón nisqawan. Chay término de Coulomb nisqa yupasqa kachkan chay campo de reacción nisqawan chaymanta 1,1 nm karu kuchusqawan. Vander Waals nisqa términoqa 1,1 nm kuchusqa karuyuqmi esquema de corte nisqawan, chaymanta Verlet esquema de corte nisqawanmi deriva potencial nisqapaq (62).
VMD nisqawanmi, DOPC fosfato nisqa perlas utaq ceramida AM1 nisqa perlas nisqawan proteína nisqawan kuchusqa onda nisqa 0,7 nm nisqa, chaymantam yupasqa hayka lípidos nisqakuna chay proteína nisqawan hukllawakusqanku. Kay fórmula nisqaman hinaqa, (63) nisqapi hina, factor de depleción-enriquecimiento (DE) nisqa yupayta: Factor DE = (proteína nisqapi llapan lípidos nisqakuna 0,7) proteína 0,7 nisqapi (llapa lípidos nisqapi Cer nisqa) .
Willasqa chaninchasqa promedio hinam tarikun, chaymanta pantay barras nisqakunam tawa independiente copiakuna SE nisqamanta. Chay significancia estadística nisqa factor DE nisqamantaqa yupasqam prueba t nisqawan [(promedioDE-factor-1)/SE]. Huk chupayuq rakiymanta P chanin yupay.
Chay GROMACS yanapakuywanmi yupasqa karqan mapa de densidad lateral 2D nisqa chay sistema Emp24 nisqayuqpa chay qhipa 250 ns nisqapi chay rastro nisqapi. Ceramidapa enriquecimiento/depleción nisqa mapa nisqa tarinapahqa, Cerpa densidad nisqa mapa nisqatam rakinchik Cerpa, DOPCpa mapapa huñusqanwan, chaymantam rakinchik Cerpa cuerpopi concentracionninwan. Chay kikin llimp’i mapa escalawanmi llamk’achisqa.
Kay qillqasqapaq yapasqa materialkunapaq, ama hina kaspa qhaway http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1
Kayqa huk kichasqa yaykuy qillqam, Creative Commons Atribución-Mana Comercial Licenciapa kamachiyninkunamanhina rakisqa, mayqinchus mayqin mediopipas llamk'achiyta, rakiyta chaymanta mirachiyta saqin, qhipa llamk'achiyta mana qhatuypaq gananciapaqchu chaymanta premisa ñawpaq llamk'ay chiqan kasqan. Willakuy.
Qhaway: Correo electrónico direccionniyki qunaykipaqlla mañaykiku chaymanta chay p'anqaman yuyaychasqayki runa yachanqa chay correo electrónico rikunankuta munasqaykita chaymanta mana spam kaqta. Manam ima correo electrónico direccionkunatapas hapisaqkuchu.
Kay tapuyqa watukuq kasqaykita pruebanapaq chaymanta kikillanmanta spam apachiyta hark'anapaq llamk'achkan.
Sofía Rodríguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gómez (Alejandro Cortes-Gómez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana María Pérez -Linero), Sergio López (Sergio López), Miho Waga (Miho Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
3D hatun resolución chiqa pacha siq’ikuna rikuchin kay ceramida cadena sayayninpa ancha chaniyuq kayninta kay proteína t’aqaypaq kay akllasqa lluqsiy sitiokunapi.
Sofía Rodríguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gómez (Alejandro Cortes-Gómez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana María Pérez -Linero), Sergio López (Sergio López), Miho Waga (Miho Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
3D hatun resolución chiqa pacha siq’ikuna rikuchin kay ceramida cadena sayayninpa ancha chaniyuq kayninta kay proteína t’aqaypaq kay akllasqa lluqsiy sitiokunapi.
©2020 Asociación Americana para el Avance de la Ciencia nisqa. tukuy hayñikuna waqaychasqa. AAAS nisqaqa HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef hinaspa COUNTER nisqakunapa yanapaqninmi. CienciaAvances ISSN 2375-2548 nisqapi.