Metabolitos inmunomoduladores huk clave característica kay microambiente tumoral (TME) kaqmanta kanku, ichaqa huk pisi excepciones kaqwan, identidadninkuqa aswanta mana riqsisqachu kanku. Kaypi, tumores kaqmanta chanta células T kaqmanta kay tumores kaqmanta chanta kay ascitis kaqmanta kay carcinoma seroso alto grado (HGSC) kaqwan unqusqakunamanta t’aqwirirqayku kay metabólomo kay hukniray compartimientos TME kaqmanta rikuchinaykupaq. Ascitis chaymanta células tumorales nisqakunaqa hatun metabolitos nisqapi hukniraymi. Ascites kaqwan tupachisqaqa, kay tumor-infiltrantes células T kaqkunaqa anchata qhapaqyachisqa kanku kay 1-metilnicotinamida (MNA) kaqwan. Aunque kay nivel de MNA kay células T kaqpi wich’asqa kachkan, kay expresión kay nicotinamida N-metiltransferasa kaqmanta (huk enzima mayqinchus cataliza kay transferencia kay grupos metilos kaqmanta kay S-adenosilmetioninamanta kay nicotinamida kaqman) kay fibroblastos chanta kay células tumorales kaqllapi. Ruwaypi, MNA kay células T kaqta kay tumor-promotor citoquina tumor necrosis factor alfa kaqta lluqsichinankupaq tanqan. Chayrayku, kay TME-derivado MNA yanapakun kay inmune regulación kaqpi kay células T kaqmanta chanta huk potencial inmunoterapia meta kaqta representan kay runap cáncer hampiyninpaq.
Kay metabolitos tumor-derivados kaqqa huk profundo inhibidor efectota kay antitumoral inmunidad kaqpi kanman, chanta aswan aswan pruebakuna rikuchinku kaytaq huk fuerza impulsora hina kay unquy progresión kaqpaq (1). Kay efecto Warburg kaqmanta aswanta, kay qhipa llamk’ayqa qallarisqa kay estado metabólico kaqmanta kay células tumorales kaqmanta chanta kay relación kaqta kay estado inmune kaqwan kay microambiente tumoral kaqmanta (TME) kaqmanta caracterizayta. Estudios kay modelos de ratas kaqmanta chanta kay células T runamanta rikuchirqanku kay metabolismo glutamina kaqmanta (2), metabolismo oxidativo kaqmanta (3) chanta kay metabolismo glucosa kaqmanta (4) sapanmanta ruwayta atinkuman kay imaymana subgrupos de células inmunes kaqpi. Kay ñankunapi achka metabolitos kaqkunaqa kay células T kaqpa antitumoral ruwayninta hark’anku. Pruebasqa kachkan kay bloqueo kay coenzima tetrahidrobiopterina (BH4) kaqmanta kay proliferación kay células T kaqmanta waqllichinman, chanta kay BH4 yapakuynin kay cuerpopi kay antitumoral inmune kutichiyta kallpachanman kay CD4 chanta CD8 kaqwan mediada. Chaymantapas, kay inmunosupresivo efectota kay kynurenina kaqmantaqa kay BH4 quywan qispichisqa kanman ( 5 ). Kay isocitrato deshidrogenasa (IDH) mutante glioblastoma kaqpi, kay secreción kay enantiometabólico (R)-2-hidroxiglutarato (R-2-HG) kaqmanta hark’an kay activación, proliferación chanta kay citolisis Actividad kaqmanta kay células T kaqmanta (6). Kunallanraq, rikuchikun kay metilglioxal, huk subproducto kay glicólisis kaqmanta, kay células supresores kaqwan ruwasqa kay origen mieloide kaqmanta, chanta kay transferencia de células T kay metilglioxal kaqmanta kay efector células T ruwayninta hark’anman. Hampiypi, kay neutralización kay metilglioxal kaqmanta kay actividadta kay células supresor derivadas de mieloides (MDSC) kaqmanta atipayta atin chanta kay terapia bloqueo de punto de control kaqmanta kay modelos de rata kaqpi sinérgistamente kallpachanman (7). Kay yachaykunaqa huñusqapi enfatizanku kay metabolitos TME-derivados kaqpa ruwaynin clave kaqta kay regulación kaqpi kay células T ruwayninta chanta actividadta.
Cáncer de ovario nisqapiqa askhan willakun células T nisqakunaq mana allin ruwayninmanta (8). Kayqa huk chiqanpi kay características metabólicas inherentes kay hipoxia kaqpi chanta kay vasculatura tumoral abnormal kaqrayku (9), kaytaq kay glucosa chanta kay triptófano kaqmanta kay subproductos kaqman tikrakun kay ácido láctico chanta kay kynurenina kaqman ima. Llumpay lactato extracelular kaqqa kay interferón-γ (IFN-γ) ruwayta pisiyachin chanta kay diferenciación kay subgrupos mielosupresores kaqmanta purichin ( 10 , 11 ). Kay triptófano mikhuyqa chiqanmanta hark’an kay proliferación de células T kaqta chanta hark’an kay señalización receptora de células T kaqta (12-14). Kay qhawaykunawanpas, askha llamk’ay metabolismo inmune muyuriqpi ruwakurqa kay cultivo de células T in vitro kaqpi kay medios optimizados kaqwan, utaq limitasqa kay modelos homólogos de ratas kaqpi in vivo kaqpi, mana mayqinpas tukuyninpichu rikuchin kay heterogeneidad kay cánceres humanos kaqmanta chanta kay fisiológico macro chanta micro medio ambiente kaqmanta.
Huk común característica kay cáncer de ovario kaqmantaqa kay peritoneal mast’arikuy chanta kay ascitis rikhuriynin. Kay ascitis kaqpi kay fluido celular huñukuyninqa huk ñawpaqman purisqa unquywan chanta mana allin pronóstico kaqwan ima hukllachasqa kachkan (15). Willakuykunamanhina, kay sapalla compartimiento hipóxico kaq, hatun niveles kaqwan kay factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) kaqwan chanta kay indoleamina 2,3-dioxigenasa (IDO) kaqwan, chanta kay células reguladoras T kaqwan chanta kay células inhibidoras mieloides kaqwan ima infiltrado kachkan (15-18). Kay ascitis kaqpa metabólico pachamamanqa hukniray kanman kay tumor kaqmanta kikinmanta, chayrayku kay reprogramación kay células T kaqmanta kay espacio peritoneal kaqpi mana sut’ichu. Chaymantapas, kay clave diferencias chanta kay heterogeneidad kay ascitis chanta metabolitos kaqkunamanta kay tumor pachamamapi kaqkuna hark’anman kay infiltración kay células inmunes kaqmanta chanta kay ruwayninkumanta kay tumores kaqpi, chanta aswan investigación necesitakun.
Kay sasachakuykunata allichanapaqmi, huk separación celular sensitiva hinallataq cromatografía líquida tándem espectrometría de masas (LC-MS/MS) nisqa ruwayta ruwarqayku, chaywanmi yacharqayku hukniray células nisqakunata (kay CD4 + hinallataq CD8 + células T nisqakunatapas) hinallataq tumorkuna ukhupi hinallataq tumorkuna ukhupipas Metabolitos nisqakunan células nisqakunata mast’arinku kikin ascitas nisqapi hinallataq tumor medio ambiente nisqapi unquqpa. Kay métodota llamk’achiyku citometría de flujo alto dimensional kaqwan chanta secuenciación ARN huk célula kaqwan (scRNA-seq) kaqwan huk retrato altamente resolucionado kay estado metabólico kaqmanta kay poblaciones clave kaqmanta qunaykupaq. Kay ruwayqa rikuchirqa huk hatun yapakuyninta kay nivel de 1-metilnicotinamida (MNA) kaqpi kay células T tumorales kaqpi, chanta kay experimentos in vitro kaqpi rikuchirqa kay efecto inmunomodulador kay MNA kaqmanta kay células T ruwayninpi ñawpaqta mana riqsisqachu karqa. Tukuypaq, kay ruwayqa rikuchin kay interacciones metabólicas mutuas kaqta kay tumores kaqwan kay células inmunes kaqwan, chanta kay metabolitos inmune regulación kaqmanta sapalla qhawaykunata qun, kaytaq allin kanman kay inmunoterapia cáncer de ovario kaqmanta hampinapaq kay células T kaqpi Hampikuy oportunidades kaqmanta.
Utilizarqayku citometría de flujo alto dimensional nisqawan kuskalla glucosa hap’iyta yupanapaq [2-(N-(7-nitrofenil-2-oxa-1,3-diaza-4-il)amino)-2-desoxiglucosa (2-NBDG) hinallataq actividad mitocondrial [MitoTracker Deep Red (MT DR)] (7, 19, 20) lado lado típico kanku marcadores kaqkuna kay células inmunes kaqta chanta kay poblaciones de células tumorales kaqta t’aqanku (Tabla S2 chanta Figura S1A). Kay análisis rikuchirqa kay células T kaqwan kikinchasqa, kay ascitis chanta kay células tumorales kaqwan aswan hatun glucosa hap’iyniyuq kasqankuta, ichaqa aswan juch’uy chiqan kay actividad mitocondrial kaqpi. Kay promedio glucosa hap’iy kay células tumorales kaqmanta [CD45-EpCAM (EpCAM)+] kimsamanta tawa kutikama kay células T kaqmanta, chanta kay promedio glucosa hap’iy kay células T CD4 + kaqmanta 1,2 kuti kay células CD8 + T kaqmanta, kaytaq rikuchin kay linfocitos infiltrantes tumorales kaqmanta (TIL) hukniray requisitos metabólicos kaqta kay kikin TME kaqpipas (Figura 1A). Kay contraste kaqpi, kay actividad mitocondrial kay células tumorales kaqpi rikch’akun kay kay células CD4 + T kaqman, chanta kay actividad mitocondrial kay iskaynin clase células kaqmanta aswan hatun kay kay células CD8 + T kaqmanta ( Figura 1B ). En general, kay ruwasqakuna rikuchinku kay nivel metabólico kaqta. Kay actividad metabólica kay células tumorales kaqmanta aswan hatun kay células CD4 + T kaqmanta, chanta kay actividad metabólica kay células T CD4 + kaqmanta aswan hatun kay células T CD8 + kaqmanta. Kay efectos kaqkuna tukuy tipos celulares kaqpi kaqtinpas, mana huk constante diferencia kanchu kay estado metabólico kaqpi kay células T CD4 + chanta CD8 + kaqpi nitaq kay proporciones relativasninkupi kay ascitis kaqpi kay tumores kaqwan kikinchasqa ( Figura 1C ). Kay contraste kaqpi, kay fracción CD45-células kaqpi, kay proporción kay células EpCAM+ kaqmanta kay tumor kaqpi yapakurqa kay ascitis kaqwan kikinchasqa ( Figura 1D ). Hinallataqmi qawarirqayku huk sut’i metabólico diferenciata EpCAM+ hinallataq EpCAM- componentes celulares nisqakuna ukhupi. EpCAM+ (tumor) células kaqkunaqa aswan hatun glucosa hap’iyniyuq chanta actividad mitocondrial kaqwan kanku kay EpCAM- células kaqmanta, kaytaq aswan hatun kay actividad metabólica kaqmanta kay fibroblastos kaqmanta kay células tumorales kaqpi kay TME kaqpi ( Figura 1, E chanta F ).
. (C) Kay ratio kay CD4 + chanta kay CD8 + células kaqmanta (kay CD3 + T células kaqmanta) kay ascitis kaqpi chanta kay tumor kaqpi. (D) Proporción kay células tumorales EpCAM + kaqmanta kay ascitis kaqpi chanta kay tumor kaqpi (CD45−). (E chanta F) EpCAM + CD45-tumor chanta EpCAM-CD45-matriz glucosa hap’iy (2-NBDG) (E) chanta actividad mitocondrial (MitoTracker yana puka) (F) gráficos representativos (ichuq) chanta datos tabulados ( Paña) Ascitis chanta células tumorales kaqwan. (G) Gráficos representativos kay CD25, CD137 chanta PD1 expresión kaqmanta kay citometría de flujo kaqwan. (H chanta I) CD25, CD137 chanta PD1 expresión kay células CD4 + T (H) chanta kay células T CD8 + (I) kaqpi. (J chanta K) Fenotipos ingenuos, central memoria (Tcm), efector (Teff) chanta efector memoria (Tem) kaqkunamanta kay expresión CCR7 chanta CD45RO kaqmanta ruwasqa. Imagenes representativas (ichuq) chanta datos tabulares (alliq) kay células T CD4 + (J) chanta células T CD8 + (K) kaqmanta kay ascitis kaqpi chanta tumores kaqpi. P valores nisqakunam determinasqa t-prueba pareada nisqawan (*P<0,05, **P<0,01 y ***P<0,001). Chiruqa tupachisqa unqusqakunatam riqsichin (n = 6). FMO, fluorescencia menos huk; MFI, mediana fluorescencia kallpa.
Aswan análisis rikuchirqa huk significativo diferencias kaqta kay altamente resolvido estado fenotípico de células T kaqpi. Kay activado (1 kaq siqi, Gmanta I kaqkama) chanta efector memoria (1 kaq siqi, J chanta K) tumores kaqpi aswan sapa kuti kanku kay ascitis kaqmanta (proporción kay CD3 + células T kaqmanta). Kikillantataq, kay fenotipota t’aqwispa kay expresión kaqwan kay marcadores de activación kaqwan (CD25 chanta CD137 kaqwan) chanta kay marcadores de depleción kaqwan [proteína de muerte celular programada 1 (PD1)] rikuchirqa kay aunque kay características metabólicas kay poblaciones kaqmanta hukniraq kanku (Figura S1, B a E) , Ichaqa mana huk diferencias metabólicas significativas kaqtaqa sapa kutichu rikukurqa kay subconjuntos ingenuos, efector utaq memoria kaqwan (Figura S1, F a I). Kay ruwakuykuna chiqanchasqa karqa kay métodos de aprendizaje automático kaqwan kay fenotipos celulares kaqmanta kikillanmanta asignanapaq ( 21 ), kaytaq astawan rikuchirqa kay askha células de médula ósea (CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO +) kaqta kay unqusqapa ascitis kaqpi ( Figura S2A ). Llapan riqsisqa laya células nisqamanta, kay población celular mieloide nisqa aswan hatun glucosa hap’iyta rikuchirqa chanta actividad mitocondrial nisqatapas (S2 siqi, Bmanta Gkama). Kay ruwakuykuna resaltanku kay sinchi metabólicos chiqan kay achkha células layakuna tarisqa kay ascitis kaqpi chanta kay tumores kaqpi kay HGSC unqusqakunapi.
Kay hatun sasachakuy kay TIL kaqpa metabonómicas características kaqninta hamut’anapaqqa kay necesidad kay muestras de células T suficiente ch’uya, calidad chanta cantidad kaqwan kay tumores kaqmanta t’aqay. Kay qhipa yachaykunaqa rikuchirqanku kay métodos de clasificación chanta enriquecimiento de perlas kay citometría de flujo kaqpi ruwasqa kay perfiles metabolitos celulares kaqpi huk cambios kaqman apayta atinman ( 22-24 ). Kay sasachakuy atipanapaq, allincharqayku kay método enriquecimiento de perlas kaqta kay TIL kaqta t’aqanaykupaq chanta t’aqanaykupaq kay cáncer de ovario humano quirúrgicamente resecado kaqmanta manaraq análisis kay LC-MS/MS kaqwan (qhaway Materiales y Métodos; Figura 2A). Kay protocolopa tukuy ima ruwayninta metabolito tikraykunapi chaninchanapaq, tupachirqayku perfiles metabolitos nisqakunata células T activadas nisqakunata qhali donantes nisqawan kay patamanta perla t’aqay ruwaymanta qhipaman células nisqawan mana perla t’aqasqa kaqkunawan ichaqa hielopi qhipakuqkunawan. Kay anlisis de control de calidad nisqapiqa tarikurqa hatun correlacin nisqa kasqanmanta kay iskay condicionkunawan (r = 0,77), chaymantam repetibilidad técnica nisqa 86 metabolitos nisqa huñupa hatun repetibilidad nisqayuq (Figura 2B). Chayrayku, kay métodos ruwayta atinku chiqan análisis metabolito kaqmanta kay células kaqpi kay enriquecimiento tipo celular kaqpi, kayhinata qun kay ñawpaq plataforma de alta resolución kaqta kay metabolitos específicos kaqta riqsichinapaq kay HGSC kaqpi, chaywantaq runakuna atikunman huk aswan ukhu hamut’ayta kay especificidad celular kaqmanta kay Programa de metabolismo sexual kaqmanta.
(A) Diagrama esquemático de perlas magnéticas qhapaqyachiymanta. Manaraq LC-MS/MS nisqawan anlisis kachkaptinqa, chay células nisqakunam kimsa kuti qatiqninpi perla magnética nisqa qhapaqyachiyta ruwanqaku utaq hielo nisqapi qipanqaku. (B) Tipo de enriquecimiento nisqapa ruwayninmi metabolitos nisqakuna achka kayninpi. Sapa qhapaqyachiy layapaq kimsa tupuypa chawpin ± SE. Gris chiruqa 1:1 nisqawanmi tupan. Chay correlacin intra-clase (ICC) nisqa kuti kuti tupuykunamanta, chaymi qawarichikun etiqueta eje nisqapi. NAD, nicotinamida adenina dinucleótido nisqa. (C) Diagrama esquemático nisqa llamkaypa puririyninpa análisis de metabolitos pacientes nisqamanta. Ascitis utaq tumores nisqakunataqa unqusqakunamanta huñunku hinaspa criopreservanku. Sapa muestramanta huk uchuy partem citometría de flujo nisqawan qawarisqa karqa, puchuq muestrakunatañataqmi kimsa ronda enriquecimiento nisqapi células CD4+, CD8+ hinaspa CD45- nisqapaq. Kay fracciones celulares nisqakunam LC-MS/MS nisqawan qawarisqa karqa. (D) Mapa calorífico nisqa abundancia de metabolitos estandarizados nisqamanta. Chay dendrograma nisqa Wardpa agrupamiento de distancias euclídeas nisqamanta muestrakunapura rikuchikun. (E) Análisis de componentes principales (PCA) mapa metabolito muestramanta, sapa muestramanta kimsa replicados rikuchispa, kikin unqusqamanta muestrakuna huk chiruwan tinkisqa. (F) Kay PCA kay perfil metabolito kaqmanta kay muestra condicionasqa kay unqusqapi (kayqa, kay redundancia parcial kaqwan); chay muestra nisqa layaqa casco convexo nisqawanmi limitasqa kachkan. PC1, hatun componente 1; PC2, hatun componente 2.
Chaymanta, kay enriquecimiento métodota churarqayku 99 metabolitos nisqakunata t’aqwinaykupaq kay CD4 +, CD8 + chanta CD45-células fracciones kaqpi kay ascites primarias kaqpi chanta kay tumores kaqpi kay suqta HGSC unqusqakunamanta ( Figura 2C, Figura S3A chanta Tabla S3 chanta S4). Kay población de interés kaqqa 2% kaqmanta 70% kaqkama kay original hatun muestra kawsaq células kaqmanta, chanta kay proporción de células kaqqa anchata t’aqakun kay unqusqakunamanta. Perlas t’aqasqamantaqa, fracción enriquecida de interés (CD4+, CD8+ utaq CD45-) nisqa aswan 85% llapan kawsaq células nisqamanta muestrapi promedio nisqapi. Kay enriquecimiento métodoqa permite analizayta kay poblaciones celulares kaqta kay metabolismo tejido tumoral runamanta, kayqa mana atikunchu ruwayta hatun muestrakunamanta. Kay protocolowan, determinarqayku kay l-kinurenina chanta adenosina, kay iskay allin caracterizados metabolitos inmunosupresores kaqkuna kay células T tumorales kaqpi utaq kay células tumorales kaqpi wicharisqa kasqankuta ( Figura S3, B y C ). Chayrayku, kay ruwasqakuna rikuchinku fidelidadta chanta atiyninta kay separación celularniykumanta chanta kay tecnología espectrometría de masasmanta kay metabolitos biológicamente importantes kaqta tarinapaq kay unqusqakunap tejidosninpi.
Análisisniykuqa rikuchirqataqmi sinchi metabólico t’aqanakuyta kay tipos celulares nisqamanta unqusqakuna ukhupi hinallataq unqusqakuna ukhupi ( Figura 2D hinallataq Figura S4A ). Aswanta, huk unqusqakunawan tupachisqa, unqusqa 70 hukniray metabólico características kaqta rikuchirqa ( Figura 2E chanta Figura S4B kaqwan), kayqa rikuchin kay heterogeneidad metabólica sustancial kaqta unqusqakunapurapi kanman. Kayqa allinmi huk unqusqakunawan tupachisqa (1,2manta 2 litrokama; Tabla S1), llapan ascitis huñusqa 70 unqusqapi (80 ml) aswan pisilla karqa. Kay control kay heterogeneidad inter-paciente kaqmanta kay análisis de componentes principales kaqpi (kayhina, análisis de redundancia parcial kaqwan) rikuchin huk constante cambios kaqta kay tipos celulares kaqpura, chanta kay tipos celulares chanta/utaq microambiente kaqmanta sut’ita huñusqa kanku kay perfil metabolito kaqmanhina (Figura 2F ). Kay análisis de metabolitos únicos kaqmanta kay efectos kaqta enfatizarqa chanta rikuchirqa kay significativas diferencias kaqta kay tipos celulares kaqmanta chanta kay microambiente kaqmanta. Kayqa allinmi kay aswan sinchi chiqan kay qhawasqa kaqqa kay MNA kaq, kaytaq aswanta qhapaqyachisqa kachkan kay células CD45- kaqpi chanta kay células CD4+ chanta CD8+ kaqpi mayqinkunachus kay tumor kaqman infiltranku ( Figura 3A ). CD4 + células kaqpaq, kay efectota aswan sut’i rikukun, chanta kay MNA kay CD8 + células kaqpipas sinchita pachamamawan afectasqa hina. Ichaqa kayqa mana ancha chaniyuqchu, imaraykuchus kimsa suqta unqusqakunamantalla chaninchakunman kay tumor CD8+ puntuacionkunapaq. MNA kaqmanta aswanta, hukniray laya células kaqpi kay ascitis kaqpi chanta tumores kaqpi, wak metabolitos mana allin caracterizados kaqkuna kay TIL kaqpi kaqkunapas diferencialmente qhapaq kanku (S3 chanta S4 siqikuna). Chayrayku, kay willaykunaqa huk prometedor conjunto de metabolitos inmunomoduladores kaqta rikuchinku aswan investigación kaqpaq.
(A) Contenido normalizado kay MNA kaqmanta kay células CD4+, CD8+ chanta CD45- kaqpi kay ascitis kaqmanta chanta tumor kaqmanta. Chay cuadro cuadro nisqapiqa rikukunmi mediana (chiru), intercuartílico nisqapa (bisagra de marco) hinaspa datos nisqapa llantuynin, 1,5 kutikama intercuartílico nisqapa (marco whisker) nisqakama. Imaynatachus Materiales y Métodos de Pacientes kaqpi willasqa, kay unqusqapa limma valorninta llamk’achiy kay P valorta riqsinapaq (*P<0.05 chanta **P<0.01). (B) Diagrama esquemático nisqa metabolismo MNA nisqamanta (60). Metabolitos: S-adenosil-1-metionina nisqa; SAH, S-adenosina-1-homocisteína nisqa; NA, nicotinamida nisqa; MNA, 1-metilnicotinamida nisqa; 2-PY, 1-metil- 2-piridona-5-carboxamida nisqa; 4-PY, 1-metil-4-piridona-5-carboxamida nisqa; NR, nicotinamida ribosa nisqa; NMN, nicotinamida mononucleótido nisqa. Enzimas (verde): NNMT, nicotinamida N-metiltransferasa; SIRT, sirtuinkuna; NAMPT, nicotinamida fosforibosil transferasa nisqa; AOX1, aldehído oxidasa 1 nisqa; NRK, nicotinamida ribosido quinasa nisqa; NMNAT, nicotinamida mono Nucleótido adenilato transferasa nisqa; Pnp1, purina nucleósido fosforilasa nisqa. (C) t-SNE kaqmanta scRNA-seq kaqmanta kay ascitis kaqmanta (gris) chanta kay tumor kaqmanta (puka; n = 3 unqusqakuna). (D) NNMT expresión kay hukniray células poblaciones kaqpi riqsichisqa scRNA-seq kaqwan. (E) Expresión kay NNMT kaqmanta chanta AOX1 kaqmanta kay SK-OV-3 kaqpi, runap riñón embrionario (HEK) 293T kaqpi, células T kaqpi chanta kay células T MNA-tratados kaqpi. Chay expresión doblada nisqa rikuchikun relativamente SK-OV-3 nisqawan. Kay patrón de expresión kay SEM kaqwan rikuchikun (n = 6 donantes saludables). Ct valores aswan hatun 35 kaqmantaqa mana detectable (UD) hina qhawasqa kanku. (F) Expresión de SLC22A1 y SLC22A2 en SK-OV-3, HEK293T, células T y células T tratadas con 8mM MNA. Chay expresión doblada nisqa rikuchikun relativamente SK-OV-3 nisqawan. Kay patrón de expresión kay SEM kaqwan rikuchikun (n = 6 donantes saludables). Ct valores aswan hatun 35 kaqmantaqa mana detectable (UD) hina qhawasqa kanku. (G) Contenido de MNA celular nisqa células T donantes saludables activadas nisqapi 72 horas MNA nisqawan incubasqamanta. Kay patrón de expresión kay SEM kaqwan rikuchikun (n = 4 donantes saludables).
MNA nisqaqa ruwakun kay metil qututa S-adenosil-1-metionina (SAM) nisqamanta nicotinamida (NA) nisqaman nicotinamida N-metiltransferasa (NNMT; Figura 3B) nisqawan t’ikraspa. NNMT kaqqa anchata expresakun kay imaymana runap cánceresninpi chanta huk proliferación, invasión chanta metástasis kaqwan ima hukllachasqa kachkan (25-27). Aswan allinta entiendenapaq kay MNApa paqariyninta kay células T kaqpi kay TME kaqpi, kay scRNA-seq kaqwan ruwarqayku kay expresión kay NNMT kaqmanta tukuy tipos celulares kaqpi kay ascitis kaqpi chanta kay tumores kaqpi kay kimsa HGSC unqusqakunamanta caracterizanaykupaq (Tabla S5). Análisis yaqa 6.500 células kaqmanta rikuchirqa kay ascitis kaqpi chanta tumor pachakunapi, expresión NNMT kaqqa restringida karqa kay presuntos poblaciones de fibroblastos chanta células tumorales kaqpi ( Figura 3, C chanta D). Kayta qhawarinapaqmi mana kanchu sut’i expresión NNMT nisqa mayqin poblaciónpipas PTPRC (CD45 +) nisqa expresaq (Figura 3D y Figura S5A), chaymi qawarichin chay MNA tarisqa espectro metabolito nisqapi células T nisqaman churasqa kasqanmanta. Aldehído oxidasa 1 (AOX1) nisqap expresionninqa MNA nisqatam 1-metil-2-piridona-5-carboxamida (2-PYR) icha 1-metil-4-piridona-5-carboxamida (4- PYR) nisqaman tikran; Figura 3B) kaqpipas restringido kachkan kay población de fibroblastos expresaq COL1A1 kaqpi (Figura S5A), kaytaq kuskamanta rikuchin kay células T mana atiyniyuq kasqankuta kay metabolismo convencional MNA kaqmanta. Kay expresión patrón kay MNA kaqwan tupaq genes kaqmanta chiqaqchasqa karqa huk iskay kaq independiente celular datos conjunto kaqwan kay ascites kaqmanta kay HGSC unqusqakunamanta ( Figura S5B; n = 6) (16). Hinallataq, análisis cuantitativo de reacción en cadena de polimerasa (qPCR) kaqmanta kay células T donantes saludables kaqmanta kay MNA kaqwan hampisqa kaqmanta rikuchirqa kay control SK-OV-3 células tumorales ovarias kaqwan tupachisqa, kay NNMT utaq AOX1 yaqa mana expresasqachu karqa ( Figura 3E ). Kay mana suyasqa ruwaykuna rikuchin kay MNA fibroblastosmanta utaq tumoresmanta kay TME kaqpi células T adyacentes kaqman t’aqakunman.
Aunque candidatos kanku kay ayllu kay transportadores catiónicos orgánicos 1 kaqmanta 3 kaqkama (OCT1, OCT2 chanta OCT3) codificasqa kay soluble portador 22 (SLC22) aylluwan (SLC22A1, SLC22A2 chanta SLC22A3), kay transportadores potenciales kay MNA kaqmanta mana definisqachu kanku (28) . QPCR kay ARNm kaqmanta kay qhali células T donantes kaqmanta rikuchirqa pisi niveles de expresión kay SLC22A1 kaqmanta ichaqa mana detectables niveles kay SLC22A2 kaqmanta, kaytaq chiqancharqa ñawpaqta willasqa kaqta kay literatura kaqpi ( Figura 3F ) ( 29 ). Kay contraste kaqpi, kay SK-OV-3 ovario tumor celular linea expresarqa altos niveles iskaynin transportadores kaqmanta ( Figura 3F ).
Kay células T nisqakuna hawa llaqtamanta MNA nisqa ch’unqay atiyniyuq kasqankuta pruebanapaqmi, células T donantes qhali kaqta 72 horasta uywarqanku, hukniray concentraciones de MNA nisqakuna kaptin. Mana MNA exógeno kaptinqa, MNApa contenido celularninqa manam tarikunchu (3G siqi). Ichaqa, células T activadas tratadas kay MNA exógena kaqwan rikuchirqanku huk dosismanta dependiente yapakuyninta kay contenido MNA kaqpi kay células kaqpi, kay 6 mM MNA kaqkama ( Figura 3G ). Kay ruwayqa rikuchin kay pisi nivel de expresión transportadora kaqmanta chanta mana kay enzima principal responsable kay metabolismo intracelular MNA kaqmanta kaqtinpas, TIL MNA kaqmanta hap’iyta atinraq.
Kay espectro metabolitos kaqmanta kay unqusqakunap células T kaqpi chanta kay experimentos in vitro kaqpi kay MNA absorción kaqpi yapan kay atiyta kay fibroblastos asociados kay cáncer kaqwan (CAF) kay MNA kaqta lluqsichinankupaq chanta kay células tumorales kaqqa kay fenotipo chanta kay TIL kaqpa ruwayninta kamachinkuman. Kay MNA kaqpa ruwayninta kay células T kaqpi yachanapaq, kay células T donantes qhali kaqta activarqanku kay in vitro kaqpi kay MNA kaqpi utaq mana kaqpi, chanta kay proliferación kaqninku chanta kay citoquinas ruwayninkumanta chaninchakurqa. 7 p’unchawmanta MNA yapaymanta aswan hatun dosis kaqpi, kay población doble yupayqa moderadamente pisiyachisqa karqa, chaymanta vigor tukuy dosis kaqpi waqaychasqa karqa (Figura 4A). Chaymantapas, hampikuy kay MNA exógena kaqmanta ruwakurqa huk yapakuy kay proporción kay células T CD4 + chanta CD8 + kaqmanta kay factor de necrosis tumoral-α kaqmanta expresaqkuna (TNFα; Figura 4B). Kay contraste kaqpi, kay intracelular ruway kay IFN-γ kaqmantaqa anchata pisiyachisqa karqa kay células CD4 + T kaqpi, ichaqa mana kay células CD8 + T kaqpichu, chanta mana huk hatun tikray karqachu kay interleucina 2 kaqpi (IL-2; Figura 4, C chanta D). Chayrayku, ensayo inmunosorbente ligado enzimas (ELISA) kay sobrenadantes kaqmanta kay MNA-tratado kay células T cultivos kaqmanta rikuchirqa huk hatun yapakuyninta kay TNFα kaqpi, huk pisiyay kay IFN-γ kaqpi, chanta mana huk tikrayta kay IL-2 kaqpi ( Figura 4, E a G). . Kay IFN-γ pisiyayninqa rikuchin kay MNA huk ruwayta ruwanman kay antitumoral actividadta kay células T kaqmanta hark’aypi. Kay MNA kaqpa ruwayninta kay citotoxicidad mediada kay células T kaqpi simulación ruwanapaq, kay células quiméricas receptora de antígeno T (FRα-CAR-T) kaqkuna kay folato receptor α kaqman chanta kay CAR-T (GFP) kaqman kay células de proteína fluorescente verde (GFP) -CAR-T) kaqwan kamachisqa, kay células mononucleares de sangre periféricas donantes (PBMC) kaqwan ruwasqa kanku. CAR-T células nisqakunam 24 horas MNA nisqapa kasqanpi uywasqa karqa, chaymantam co-cultivasqa karqa runapa SK-OV-3 células tumorales ovarias nisqawan expresaq folato receptor α nisqawan huk ratio efectorwan diana nisqawan 10:1 nisqapi. MNA hampiyqa huk ancha pisiyaynintam ruwarqa wañuchiy ruwaypi FRα-CAR-T células nisqapi, chaymi rikchakurqa FRα-CAR-T células adenosinawan hampisqaman ( Figura 4H ).
(A) Total conteo de células viables chaymanta doblezamiento poblacional (PD) directamente culturamanta 7 p’unchawpi. N = 3 independiente experimentokunamantapas willakuykunatam qawachin. (Bmanta Dkama) CD3/CD28 chaymanta IL-2 llamk’achikurqa kay células T activanankupaq kay concentraciones MNA kaqninkupi 7 p’unchawkama. Manaraq análisis ruwakuchkaptinqa, células nisqakunatam PMA/ionomicina nisqawan GolgiStop nisqawan 4 horasta kallpancharqaku. TNFα (B) nisqa expresión nisqa células T nisqapi. Ejemplo siq’i (ichuq) chanta tabular datos (alliq) kay TNFα expresión kaqmanta kawsaq células kaqpi. IFN-γ (C) chaymanta IL-2 (D) expresión kay células T kaqpi. Chay expresión de citoquinas nisqa tupukurqa citometría de flujo nisqawan. Chay gráfico de barras nisqapin rikukun promedio (n = 6 donantes saludables) + SEM. Análisis de varianza de una vía y repetida medidas (*P<0.05 y **P<0,01) nisqawanmi P valor nisqa tarina. N = 3 independiente experimentokunamantapas willakuykunatam qawachin. (E a G) CD3/CD28 chaymanta IL-2 nisqawanmi células T nisqakunata activarqaku sapakamapa concentraciones MNA nisqapi 7 punchawkama. Chay medioqa huñusqa karqa manaraq 4 horas PMA/ionomicina estimulación kachkaptin chaymanta qipaman. Chay concentraciones de TNFα (E), IFN-γ (F) y IL-2 (G) nisqakunam tupusqa karqa ELISA nisqawan. Chay gráfico de barras nisqapin rikukun promedio (n = 5 donantes saludables) + SEM. P valor determinasqa huk ñan anlisis de varianzawan chaymanta kuti kuti tupuykunawan (*P<0.05). Ch’iku chiruqa tariypa tariy limite nisqatam qawarichin. (H) Ensayo de lisis celular nisqa. FRα-CAR-T utaq GFP-CAR-T células nisqakunatam adenosina (250μM) utaq MNA (10 mM) nisqawan 24 horasta allicharqaku, utaq mana hampisqa saqirqaku (Ctrl). Chay pachakmanta huknin wañuchiymi tupukurqa SK-OV-3 células nisqamanta. P valor nisqa Welch t pruebawan tarisqa (*P<0,5 y **P<0,01).
Kay MNA-dependiente TNFα expresión kamachiymanta huk mecánico hamut’ayta tarinapaq, kay TNFα mRNA kaqpi tikrakuykuna kay MNA-wan hampisqa células T kaqmanta chaninchakurqa ( Figura 5A ). Kay qhali células T donantes kay MNA kaqwan hampisqa rikuchirqanku huk iskay kuti yapakuyninta kay TNFα transcripción niveles kaqpi, kaytaq rikuchin kay MNA kay TNFα transcripcional regulación kaqmanta dependiente kaqta. Kay atikuq mecanismo reguladorta investiganapaq, iskay riqsisqa factores de transcripción kaqkuna kay TNFα kaqta kamachin, kaytaq factor nuclear de células T activadas (NFAT) chanta kay proteína específica 1 (Sp1) kaqwan, chaninchakurqanku kay MNA kay promotor proximal TNFα kaqman hukllanakuyman kutichiypi ( 30 ). Kay TNFα promotor 6 riqsisqa NFAT kaqman hukllanakuy sitiokunata chanta 2 Sp1 hukllana sitiokunata hap’in, huk sitiopi hukllanakunku [-55 bases pares (bp) kay 5’cap kaqmanta] (30). Inmunoprecipitación cromatina (ChIP) rikuchirqa kay MNAwan hampisqa kaptin, kay Sp1pa kay TNFα promotorman hukllanakuynin kimsa kutita yapakusqanmanta. Chaynallataqmi NFAT nisqapa churakuyninpas yapakurqa, chaynallataqmi importanciamanpas asuykurqa (5B siqi). Kay willaykunaqa rikuchinku kay MNA kay expresión kay TNFα kaqmanta kay Sp1 transcripción kaqnintakama kamachin, chanta aswan pisita kay expresión kay NFAT kaqmanta.
(A) Mana MNA kaqwan uywasqa células T kaqwan tupachisqa, kay pliegue cambio kay TNFα expresión kaqmanta kay células T tratadas MNA kaqwan. Kay patrón de expresión kay SEM kaqwan rikuchikun (n = 5 donantes saludables). N = 3 independiente experimentokunamantapas willakuykunatam qawachin. (B) Kay TNFα promotor kay células T hampisqa utaq mana 8 mM MNA kaqwan kay NFAT chaymanta Sp1 kaqmanta hukllachasqa karqa (Ctrl) kaqwan chanta kay PMA/ionomicina estimulación kaqwan 4 horas. Inmunoglobulina G (IgG) chanta H3 kaqwan controles negativos chanta positivos hina inmunoprecipitación kaqpaq llamk’achikurqa, respetuosamente. Kay cuantificación kay ChIP kaqmanta rikuchirqa kay Sp1 chanta kay NFAT kay TNFα promotorman hukllanakuynin kay MNAwan hampisqa células kaqpi askha kutita yapakurqa kay control kaqwan kikinchasqa. N = 3 independiente experimentokunamantapas willakuykunatam qawachin. P valor nisqa achka t-pruebakunawan tarisqa (*** P <0.01). (C) HGSC kaqpa ascitas kaqwan tupachisqa, células T (mana citotóxicas kaqwan) rikuchirqanku expresión TNF yapasqa kaqta kay tumor kaqpi. Chay colorkunaqa hukniray onqosqakunatan representan. Chay rikuchisqa células nisqakunaqa 300 nisqamanmi muestreo al azar ruwasqaku, chaymantam jittered nisqa, chaynapi sobredibujo nisqa limitananpaq (** Padj = 0,0076). (D) Modelo propuesto de MNA kay cáncer de ovario kaqpaq. MNA nisqaqa tumor células nisqapi, fibroblastos nisqapitaq TME nisqapi ruwakun, chaymantataq células T nisqawan hap’isqa. MNA yapan kay Sp1 kaqpa hukllanakuynin kay TNFα promotor kaqman, kaytaq apamun kay TNFα transcripción yapasqaman chanta kay TNFα citoquina ruwayman. MNA nisqapas IFN-γ nisqa pisiyaynintam ruwan. Kay células T ruwayninta hark’ayqa pisiyachisqa wañuchiy atiyman chanta kay tumor usqhaylla wiñayninman ima apamun.
Willakuykunamanhina, TNFα ñawpaqmanta chanta qhipamanta dependiente antitumoral chanta antitumoral efectosniyuq, ichaqa allin riqsisqa ruwayniyuq kay wiñayninta chanta metástasis cáncer de ovario kaqmanta kallpachaypi (31-33). Willakuykunamanhina, kay concentración kay TNFα kaqmanta kay ascitis kaqpi chanta kay tumor tejidos kaqpi kay cáncer de ovario kaqwan unqusqakunapi aswan hatun kay tejidos benignos kaqmanta ( 34-36 ). Mecanismo kaqmanta, TNFα kay activación, función chanta proliferación kay yuraq yawar ch’unchulkunamanta kamachiyta atin, chanta kay fenotipo kay células cánceres kaqmanta tikrayta atin ( 37 , 38 ). Kay tarikuykunawan kuska, análisis de expresión génica diferencial rikuchirqa kay TNF anchata up-regulado kaqta kay células T kaqpi kay tumor tejidos kaqpi kay ascitis kaqwan kikinchasqa ( Figura 5C ). Kay TNF expresión yapakuyninqa rikukurqalla kay poblaciones de células T kaqpi huk fenotipo mana citotóxico kaqwan ( Figura S5A ). Resumenpi, kay willaykunaqa kay qhawayta yanapan kay MNA iskay inmunosupresores chanta tumor promotores efectosniyuq kay HGSC kaqpi.
Etiquetado fluorescente nisqa citometría de flujo nisqapi ruwasqaqa aswan hatun ruwaymanmi tukupun metabolismo TIL nisqamanta yachanapaq. Kay yachaykunaqa rikuchirqanku kay linfocitos periféricos yawarmanta utaq células T kaqwan tupachisqa kay órganos linfoides secundarios kaqmanta, kay TIL murino chanta runamanta aswan hatun tendenciayuq kanku kay glucosa hap’inankupaq ( 4 , 39 ) chanta kay pisi pisimanta chinkachiy kay función mitocondrial kaqmanta ( 19 , 40 ). Kay yachaypi kaqlla ruwaykunata rikurqayku chaypas, kay llalliq wiñayninqa tupachiymi kay metabolismo kay células tumorales kaqmanta chanta kay TIL kaqmanta kikin resecado tumor tejido kaqmanta. Wakin kay ñawpaq willakuykunawan kuska, kay tumor (CD45-EpCAM +) células kay ascitis kaqmanta chanta kay tumores kaqmanta aswan hatun glucosa hap’iyniyuq kanku kay CD8 + chanta CD4 + células T kaqmanta, kaytaq yanapan kay hatun glucosa hap’iy kay células tumorales kaqmanta kay células T kaqwan kikinchasqa kanman. Células T atipanakuymanta hamutay. TME. Ichaqa, kay actividad mitocondrial kay células tumorales kaqmanta aswan hatun kay kay células CD8 + T kaqmanta, ichaqa kay actividad mitocondrial kaqqa kay células T CD4 + kaqman rikch’akun. Kay ruwakuykuna kallpachanku kay rikhuriq tema kaqta kay metabolismo oxidativo kaqqa ancha chaniyuq kay células tumorales kaqpaq ( 41 , 42 ). Hinallataq ninku kay células CD8 + T aswan suceptibles kankuman kay disfunción oxidativa kaqman kay células CD4 + T kaqmanta, utaq kay células T CD4 + T llamk’achinkuman kay fuentes de carbono mana glucosa kaqmantachu kay actividad mitocondrial kaqta waqaychanankupaq ( 43 , 44 ). Kayta qhawarina tiyan kay mana hukniraytachu rikurqayku kay glucosa hap’iypi utaq kay actividad mitocondrial kaqpi kay CD4 + T efectores kaqpi, kay T efector memoria kaqpi chanta kay T central memoria células kaqpi kay ascitis kaqpi. Kikillantataq, kay estado diferenciación kaqmanta kay células CD8 + T kaqmanta kay tumores kaqpi mana ima ruwayniyuqchu kay cambios kaqwan kay glucosa hap’iypi, kaytaq resaltan kay significativa diferencia kay células T cultivadas kaqmanta kay in vitro kaqpi chanta kay runamanta TIL in vivo kaqpi ( 22 ). Kay qhawaykunaqa chiqanchakurqataqmi kay asignación automática de población celular mana sesgada kaqwan, kaytaq astawan rikuchirqa kay células CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO + aswan hatun glucosa hap’iywan chanta actividad mitocondrial kaqwan kay células tumorales kaqmanta aswan riqsisqa kanku ichaqa kay población celular activa Metabólica kaqwan. Kay población kaqqa kay subpoblación putativa kaqta kay células supresor mieloides kaqmanta utaq kay células dendríticas plasmacitoides kaqmanta riqsichikunman kay análisis scRNA-seq kaqpi riqsichisqa. Iskaynin kaykunamanta willasqaña kanku kay tumores ovarios kaqpi runap ovario kaqpi [45], kunankamapas necesitanku Aswan llamk’ayqa kay subpoblación mieloide kaqmanta willanapaq.
Aunque kay métodos basados ​​kay citometría de flujo kaqpi kay diferencias generales kay glucosa kaqpi chanta kay metabolismo oxidativo kaqpi kay tipos celulares kaqpi sut’inchayta atinku, kay metabolitos precisos ruwasqa kay glucosa kaqwan utaq wak fuentes de carbono kaqwan kay metabolismo mitocondrial kaqpaq kay TME kaqpi manaraq determinasqachu kanku. Asignar kay metabolitos kaqta utaq mana kaqta huk qusqa TIL subconjunto kaqman kay purificación kay población celular kaqmanta kay tejido excised kaqmanta necesitan. Chayrayku, kay método enriquecimiento celularniyku espectrometría de masas kaqwan kuskachasqa, kay metabolitos kaqmanta qhawaykunata quyta atin mayqinkunachus diferencialmente qhapaqyachisqa kanku kay células T kaqpi chanta kay poblaciones de células tumorales kaqpi kay tupachisqa unqusqa muestrakunapi. Aunque kay método ventajasniyuq kay fluorescencia-activada células clasificación kaqmanta, wakin bibliotecas metabolitos kaqmanta afectasqa kankuman kay estabilidad inherente kaqrayku chanta/utaq kay tasa de rotación usqhayrayku ( 22 ). Chaywanpas, kay métodoykuqa iskay riqsisqa metabolitos inmunosupresores kaqta riqsiyta atirqa, adenosina chanta kynurenina kaqwan, imaraykuchus anchata t’aqakunku kay tipos de muestra kaqpi.
Kay análisis metabonómico kaqniyku kay tumores kaqmanta chanta kay subtipos TIL kaqmanta aswan qhawaykunata qun kay metabolitos ruwayninmanta kay TME ovario kaqpi. Ñawpaqta, citometría de flujo kaqwan, mana hukniray kaqta tarirqaykuchu kay actividad mitocondrial kaqpi kay tumores kaqwan kay células T CD4 + kaqwan. Ichaqa, análisis LC-MS/MS kaqpi rikuchirqa hatun tikraykunata kay abundancia metabolitos kaqpi kay poblaciones kaqpi, kaytaq rikuchirqa kay conclusiones kay metabolismo TIL kaqmanta chanta kay actividad metabólica tukuyninmanta ima, necesitanku allin interpretación kaqta. Iskay kaqpi, MNA metabolito aswan hatun chiqan kay CD45-células kaqwan kay células T kaqwan kay ascitis kaqpi, mana tumores kaqpichu. Chayrayku, compartimentalización chanta tumorpa tarikuyninqa hukniray efectosniyuq kanman kay metabolismo TIL kaqpi, kaytaq resaltan kay heterogeneidad atikuq kaqta huk qusqa microambiente kaqpi. Kimsa kaq, kay expresión kay enzima MNA-productor NNMT kaqmantaqa aswanta CAF kaqpi limitasqa kachkan, kayqa células tumorales aswan pisi kaqpi, ichaqa kay niveles de MNA detectables kaqta rikukun kay células T tumor-derivadas kaqpi. Kay sobreexpresión kay NNMT kaqmanta kay CAF ovario kaqpi huk riqsisqa cáncer-promotor efectota ruwan, huk chiqanpi kay CAF metabolismo promoción kaqrayku, kay tumor invasión kaqmanta chanta kay metástasis kaqmanta ima ( 27 ). Aunque kay nivel general kay TIL kaqmantaqa chawpi kaq, kay expresión kay NNMT kaqmanta kay CAF kaqpiqa anchata huk subtipo mesenquimal Atlas del Genoma del Cáncer (TCGA) kaqwan hukllachasqa kachkan, kaytaq huk mana allin pronóstico kaqwan hukllachasqa kachkan ( 27 , 46 , 47 ). Tukuyninpaq, kay expresión kay enzima AOX1 responsable kay MNA degradación kaqmantaqa limitasqallataq kay CAF población kaqpi, kaytaq rikuchin kay células T mana atiyniyuq kasqankuta kay MNA metabolización kaqpaq. Kay ruwakuykuna yanapan kay yuyayta, aunque aswan llamk’ay necesitakun kay tarikuy chiqaqchaypaq, altos niveles de MNA kay células T kaqpi huk microambiente inmunosupresivo CAF kaqta rikuchinman.
Kay pisi nivel de expresión kaqmanta kay transportadores MNA kaqmanta chanta kay niveles indetectables kaqmanta kay proteínas clave kaqmanta kay metabolismo MNA kaqpi involucrasqa kaptin, kay MNA kaqpa kaynin kay células T kaqpi mana suyasqachu. Ni NNMT nitaq AOX1 kaqtapas riqsiyta atikurqachu kay análisis scRNA-seq kaqwan chanta kay qPCR dirigida kaqwan kay iskay independientes cohortes kaqmanta. Kay ruwakuykuna rikuchinku kay MNA mana sintetizasqachu kay células T kaqwan, aswanpis absorbido kay TME muyuriqmanta. Experimentos in vitro nisqapiqa rikukunmi células T nisqakuna MNA exógeno nisqa huñuyta munasqankuta.
Kay in vitro yachayniykuqa rikuchirqanku kay MNA exógena kaqta kay expresión kay TNFα kaqmanta kay células T kaqpi induce chanta kay Sp1 kay TNFα promotor kaqman hukllanakuyninta kallpachan. TNFα iskaynin antitumoral chanta antitumoral ruwaykunayuq kaptinpas, kay cáncer de ovario kaqpi, kay TNFα kay cáncer de ovario wiñayninta kallpachanman (31-33). Kay neutralización kay TNFα kaqmanta kay cultivo celular tumoral ovario kaqpi utaq kay TNFα señalta chinkachiy kay modelos de rata kaqpi allinchayta atinman kay TNFα-mediada citoquinas inflamatorias ruwayta chanta kay tumor wiñayninta hark’anman ( 32 , 35 ). Chayrayku, kay casopi, kay TME-derivado MNA huk metabolito proinflamatorio hina huk mecanismo TNFα-dependiente kaqwan kay autocrino bucle kaqnintakama ruwayta atin, chaywantaq kay cáncer de ovario rikhuriyninta chanta mast’arikuyninta kallpachan ( 31 ). Kay atiypi hapipakuspa, kay bloqueo TNFα kaqmanta yachakuchkan huk agente terapéutico potencial hina kay cáncer de ovario kaqpaq ( 37 , 48 , 49 ). Chaymantapas, kay MNA kay citotoxicidad kaqta kay células CAR-T kaqmanta kay células tumorales ovarias kaqman mana allintachu ruwan, kaytaq aswan pruebakunata qun kay MNA-mediada inmune supresión kaqpaq. Huñusqapi, kay ruwakuykuna huk modelota yuyaychanku maypichus tumores chanta células CAF kaqkuna MNA kaqta kay TME extracelular kaqman secretanku. Kay (i) TNF-inducida cáncer de ovario wiñaynin kallpachaywan chanta (ii) MNA-inducida actividad citotóxica de células T hark’aywan, kayqa iskay tumor efectota ruwanman ( Figura 5D ).
Tukuchinapaq, huk combinación usqhaylla enriquecimiento celular kaqmanta, secuenciación huk célula kaqmanta chanta perfil metabólico kaqmanta ima, kay yachayqa rikuchirqa kay hatun diferencias inmunometabolómicas kaqta kay tumores kaqmanta chanta kay células ascitis kaqmanta kay HGSC unqusqakunapi. Kay tukuypaq t’aqwiyqa rikuchirqa kay glucosa hap’iypi chanta kay actividad mitocondrial kaqpi kay células T kaqpi hukniray kasqankuta, chanta kay MNA kaqta riqsichirqa huk metabolito regulador inmune autónomo mana celular kaqta hina. Kay willaykunaqa huk impactoyuq kanku imaynatachus TME metabolismo de células T kaqta kay runap cánceresninpi afectan. Aunque willasqaña kay directa competencia kay nutrientes kaqpaq kay células T kaqwan kay células cánceres kaqwan, kay metabolitos kaqkunaqa kay reguladores indirectos hina ruwayta atinkuman kay tumor progresión kaqta kallpachanankupaq chanta ichapas kay inmune respuestas endógenas kaqta supriminkuman. Kay aswan sut’inchaynin kay ruway ruwaymanta kay metabolitos reguladores kaqmanta kicharinman huk estrategias alternativas kaqta kay antitumoral inmune kutichiyta kallpachaypaq.
Unqusqakunap especímenes chanta clínicos willayninkuna kay BC cáncer tumor tejido waqaychasqa kaqnintakama jap’isqa karqa kay Canadian Tissue Repository Network kaqwan certificasqa. Kay protocolo kaqmanhina kay Comité de Ética de Investigación de Cáncer BC kaqwan chanta kay Universidad de Columbia Británica kaqwan (H07-00463) aprobasqa, tukuy unqusqakunap especímenes chanta datos clínicos kaqwan ruwasqa consentimiento informado escrito kaqwan utaq formalmente renunciasqa consentimientonkuta. Chay muestrakunaqa waqaychasqam kachkan BioBank certificado (BRC-00290) nisqapi. Detallada características de pacientes rikuchikun kay Tablas S1 chanta S5 kaqpi. Criopreservación nisqapaqqa, bisturí nisqawanmi unquqpa tumor muestranta mecánicamente ismunku, chaymantataq 100 micras nisqa filtro nisqawan tanqanku, chhaynapi huk suspensión celular nisqallata tarinankupaq. Unqusqapa ascitisnintam centrifugarqaku 1500 rpm nisqapi 10 minuto 4°C nisqapi, chaynapi células nisqakunata pellet nisqaman hina ruwanankupaq, chaymantam chay hawa yakuta hurqurqaku. Tumormanta, ascitismanta ima células nisqakunam crioconservasqa karqa 50% suero humano AB inactivado ruphaywan (Sigma-Aldrich), 40% RPMI-1640 (Thermo Fisher Scientific) hinaspa 10% sulfóxido de dimetil nisqapi. Kay waqaychasqa suspensiones de células únicas nisqakunam descongelasqa karqa hinaspam metabolómica nisqapaq chaynallataq metabolito nisqapa determinacionninpaqpas llamkachisqa karqa, chaytam uraypi willakun.
Chay hunt’asqa chawpiqa 0,22 μm filtrado 50:50 yapasqa RPMI 1640: AimV nisqamanta ruwasqam. RPMI 1640 + 2,05 mM l-glutamina (Thermo Fisher Scientific) nisqawan yapasqa 10% ruphaywan inactivado runa AB suero (Sigma-Aldrich), 12,5 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific), 2 mM l-glutamina (Thermo Fisher Scientific) Fisher Scientific), 1 x Penicilina Estreptomicina (PenStrep) nisqapa chullusqan (Thermo Fisher Scientific) nisqawan 50 μMB-mercaptoetanol nisqawan. AimV (Invitrogen) nisqa 20 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific) nisqawan, 2 mM l-glutamina nisqawan (Thermo Fisher Scientific) nisqawan yapasqa. Chay tampón de tinción citometro de flujo nisqa 0,22μm filtrado fosfato tamponado salina (PBS; Invitrogen) nisqamanta ruwasqa karqan, 3% ruphaywan inactivado AB runa suero (Sigma) nisqawan yapasqa. Kay tampón enriquecimiento celular nisqa 0,22μm PBS filtrado nisqamanta ruwasqa kachkan chaymanta 0,5% suero humano AB inactivado ruphaywan (Sigma-Aldrich) yapasqa.
37°C hunt’asqa chawpipiqa, células nisqakunatam 10 nM MT DR nisqawan, 100 μM 2-NBDG nisqawan ima 30 minutos tintarqaku. Chaymantaqa, células nisqakunatam tintarqaku tinte de viabilidad eF506 nisqawan 4°C nisqapi 15 minuto. Chay células nisqakunatam FC Block (eBioscience) hinaspa Brilliant Stain Buffer (BD Biosciences) nisqapi kaqmanta suspendiy, citometro de flujo tampón de tinción nisqapi diluy (ruraqpa kamachisqanman hina), hinaspa 10 minuto temperatura ambiente nisqapi incubar. Células nisqakunata huk conjunto de anticuerpos nisqawan (Tabla S2) tampón de tinción de citometría de flujo nisqapi 4°C nisqapi 20 minutos nisqapi tintay. Chay células nisqakunataqa tampón de tinción citometría de flujo nisqapi (Cytek Aurora; configuración 3L-16V-14B-8R) manaraq análisis ruwachkaspa, musuqmanta suspendiy. SpectroFlo chaymanta FlowJo V10 llamk'achiy celda yupay willayta t'aqwinapaq, chaymanta GraphPad Prism 8 llamk'achiy willayta ruwanapaq. Kay mediana intensidad de fluorescencia (MFI) kay 2-NBDG kaqmanta chanta kay MT DR kaqmanta log-normalizado karqa, chanta huk prueba t pareada kaqwan ruwakurqa kay análisis estadístico kaqpaq kay tupachisqa unqusqakunamanta cuentata qunapaq. Llapan 40manta pisi sucesoyuq poblaciones nisqakunatam anlisismanta hurquna; ima mana allin chanikunapaqpas 1 IMF nisqa chaninchayta churay manaraq análisis estadístico nisqa ruwachkaspa, datos nisqa qawarichiytapas ruwachkaspa.
Chaynapi, chay panel de proceso manualpa estrategia de gating manual nisqawan yapanapaq, FlowJo nisqapi wañusqa células nisqakunata chinkachisqanchikmanta, forma restricción sacha (FAUST) (21) nisqawan huntasqa anotación nisqawan yanapachikurqayku. Makiwan kamachiyku kay lluqsiyta hukllanapaq kay poblaciones kaqta mayqinkunachus mana allin asignasqa hina kanku (PD1+ kaqwan kay PD1-tumoral células kaqwan hukllanakuspa) chanta kay poblaciones retenidas kaqwan. Sapa muestrapiqa promediopiqa 2% masnin células nisqakunam kachkan, llapanpiqa 11 poblaciones nisqapaqmi.
Centrifugación de densidad de gradiente de Ficoll nisqawanmi PBMC nisqa t’aqasqa karqan leucocitos t’aqay rurukunamanta (STEMCELL Technologies). CD8 + T células nisqakunatam PBMC nisqamanta hurqurqaku CD8 MicroBeads (Miltenyi) nisqawan hinaspam mastarirqaku huntasqa medio nisqapi TransAct (Miltenyi) nisqawan 2 semanas ruwaqpa kamachisqanman hina. Chay células nisqakunatam 5 punchaw sayachirqaku huntasqa medio nisqapi IL-7 (10 ng/ml; PeproTech) nisqayuqpi, chaymantam TransAct nisqawan musuqmanta kallpancharqaku. 7 punchawpi, ruwaqpa kamachisqanman hina, runapa CD45 MicroBeads (Miltenyi) nisqawanmi células nisqakunata qhapaqyachirqaku kimsa kuti qatiqninpi. Chay células nisqakunam alicuotasqa karqa análisis de citometría de flujo nisqapaq (imaynam ñawpaqpi willakusqanman hina), huk millón células nisqakunatam kimsa kutita alicuota ruwarqaku análisis LC-MS/MS nisqapaq. Chay muestrakunataqa LC-MS/MS nisqawanmi ruwakurqa uraypi willakusqanman hina. Chay faltasqa metabolito nisqapa chaninmi 1.000 ion yupaywan yuparqaniku. Sapa muestraqa normalizasqam llapan iones yupaywan (TIC), logarítmicamente tikrasqa hinaspa kikillanmanta normalizasqa MetaboAnalystR nisqapi manaraq análisis ruwakuchkaptin.
Sapa unqusqamanta huklla célula suspensión nisqa descongelasqa hinaspa filtrado 40 μm filtro nisqawan hunt’asqa medio nisqaman (imaynachus ñawpaqpi willasqa hina). Ruwaqpa protocolonman hinaqa, kimsa qatiqnin rondakunam allin akllayta ruwakurqa MicroBeads (Miltenyi) nisqawan perlas magnéticas rakiywan, chaywanmi muestrakunata qhapaqyachirqaku CD8+, CD4+ hinaspa CD45- células nisqapaq (hielo nisqapi). Pisi rimayllapi, células nisqakunataqa tampón enriquecimiento celular nisqapi (hanaqpi willasqa hina) musuqmanta suspendinku, hinaspa yupanku. Chay células nisqakunatam incubarqunku runapa CD8 perlasninwan, runapa CD4 perlasninwan utaq runapa CD45 perlasninwan (Miltenyi) 4°C nisqapi 15 minuto, chaymantam mayllarqaku tampón enriquecimiento celular nisqawan. Chay muestraqa pasakunmi columna LS (Miltenyi) nisqapi, chaymantam huñukun fracciones positivas y negativas nisqakuna. Kay unayta pisiyachinapaq chanta kay celular recuperación llamk’ayta aswan hatun ruwanapaq, chaymanta kay CD8-fracción iskay kaq ronda kay CD4+ qhapaqyachiypaq llamk’achisqa, chanta kay CD4-fracción llamk’achisqa kay qhipa CD45-qhapaqyachiypaq. Chay solucionta hielopi waqaychay tukuy t’aqanakuy ruwaypi.
Análisis de metabolitos nisqapaq muestrakunata wakichinapaqqa, células nisqakunatam huk kutita mayllarqaku hielo hina chiri kachiwan, chaymantam sapa muestraman 1 ml metanol 80% nisqawan yapaykurqaku, chaymantam vortex nisqawan ruwarqaku hinaspam nitrógeno líquido nisqapi snap congelarqaku. Chay muestrakunatam kimsa ciclo de congelación-descongelación nisqaman churarqaku, chaymantam centrifugarqaku 14.000 rpm nisqapi 15 minuto 4°C nisqapi. Chay metabolitos nisqayuq hawa yakuqa ch’akinankamam ch’akichisqa. Chay metabolitos nisqakunatam yapamanta chulluchirqaku 50 μl ácido fórmico 0,03% nisqapi, vortex nisqawan chaqrunankupaq, chaymantam centrifugarqurqaku, chaynapi imapas q’upakunata hurqunankupaq.
Metabolitos nisqakunata hurquy hawapi nisqanchikman hina. Chay hawa yakuta huk hatun ruwayniyuq cromatografía líquida nisqa botellaman apachiy metabolómica nisqamanta investigacionpaq. Huk protocolo de tratamiento aleatorio kaqwan sapa muestra kaqwan hampinapaq huk kaqlla yupay células kaqwan hark’anapaq efectos de lote kaqwan. Ruwarqayku huk evaluación cualitativa metabolitos globales nisqamanta ñawpaqta publicasqa AB SCIEX QTRAP 5500 Triple Cuadrupolo Mass Espectrometer (50) nisqapi. Análisis cromatográfico nisqapas, área pico nisqapa integracionninpas ruwakurqa MultiQuant versión 2.1 software (Applied Biosystems SCIEX) nisqawanmi.
Chay 1000 yupay iones nisqawanmi yupasqa karqan chay valor de metabolito faltante nisqa, chaymantatahmi sapa muestrapa TIC nisqawan yupasqa karqan sapa metabolito detectado nisqapa área pico normalizada nisqa yupasqa kananpaq, chaynapi chay cambiokuna riqsichisqa kananpaq chay análisis instrumental nisqawan procesamiento de muestras nisqamanta. TIC normalizasqa kaptin, MetaboAnalystR(51) (parámetro predeterminado) llamk'achisqa logarítmica tikraypaq chaymanta automático norma chiru escalacionpaq. PCA kaqwan vegano R paquete kaqwan ruwarqayku análisis exploratorio metabolomo diferencias kaqmanta kay muestra layakunapura, chanta análisis de redundancia parcial kaqwan unqusqakunata t’aqwinaykupaq. Método Ward nisqawanmi ruwakun dendrograma de mapa de calor nisqa, chaywanmi muestrakunapura karu euclídeo nisqa huñusqa kanqa. Kay limma (52) kaqwan kay abundancia metabolito estandarizada kaqpi llamk’achirqayku kay metabolitos diferencialmente abundantes kaqta riqsichinaykupaq tukuy tipo celular kaqpi chanta kay microambiente kaqpi. Sut’inchayta pisiyachinapaqqa, parámetro medio de grupo nisqawanmi modelo nisqa riqsichiyku, chaymantam microambiente nisqapi celulakunapa layakunata sapa huñu hina qawarinchik (n = 6 huñukuna); prueba de significación kaqpaq, kimsa kuti kuti tupuykunata ruwarqayku sapa metabolito kaqpaq Mana llulla replicación kananpaq, unqusqa huk hark’a hina churasqa karqa kay diseño limma kaqpi. Kay metabolitos chiqan kasqankuta qhawanapaq hukniray unqusqakunamanta, kay modelo limma kaqmanta unqusqakunata churaspa huk takyasqa ñanpi allincharqayku. Willayku kay significancia kay contraste pre-especificado kaqmanta kay tipo celular kaqmanta kay microambiente kaqmanta kay Padj <0.05 kaqmanta (corrección Benjamini-Hochberg).
Vigor qhapaqyachiymanta qhipaman kay Miltenyi Dead Cell Removal Kit kaqwan (>80% viabilidad), secuenciación de transcriptoma de una sola célula ruwakurqa kay tukuy kawsaq congelado ascitas kaqpi chanta kay tumor muestrakunapi huk protocolo de expresión 10x 5′génica kaqwan. Pichqa casos kaqwan tumores kaqwan chanta ascitis kaqwan tupachisqa karqanku, ichaqa kay pisi viabilidad huk muestra tumoral kaqmanta hark’arqa kay inclusión kaqta. Askha akllanakuna unqusqakunamanta aypanapaq, sapa unqusqamanta muestrakunata hukllawarqayku kay carriles kaqpi kay controlador de cromo 10x kaqpi, chanta sapanmanta t’aqwirqayku kay ascitis chanta tumor sitios kaqmanta. Secuenciación ruwasqamanta [Illumina HiSeq 4000 28×98 bp pares tukukuy (PE), Quebec genoma; huk promedio 73.488 chanta 41.378 ñawiriykunata sapa célulamanta tumorpaq chanta ascitispaq respetuosamente]], CellSNP chanta Vireo (53) kaqwan (CellSNP kaqpi sayasqa kayhina Kay común runa SNP (VCF) qusqa GRCh38 kaqwan huk donante identidadta qusqa. excluyendo células no asignadas y células identificadas como dúplex y comparando donantes entre ascitas y muestras tumorales (54) Kay ruwaypiqa, kimsa casos nisqakunatam waqaycharqanchik abundante representación celular nisqayuqta tumorpi chaynallataq ascites nisqapipas análisis de aguas abajo nisqapi ruwasqaykumanta huk paso de filtración masiva nisqawan chay embalaje BioConductor nisqapi (2792 and 4183 cells from tumor and ascites, respectively) for analysis. We use igraph's (57) Louvain clustering of shared nearest neighbor network (SNN) based on Jaccard distance to cluster cells by expression. The clusters were manually annotated to putative cell types based on marker gene expression and visualized with t-SNE. Cytotoxic T cells are definisqa kay expresión kaqwan kay CD8A kaqmanta chanta kay GZMA kaqmanta, mana subclústeres kaqwan kay pisi expresión proteica ribosómica kaqwan kay Izar et al (16) kaqmanta publicasqa willaykunaman yaykurqayku, kay t-SNE incrustacionesninkumanta ima, kay expresión superposición kaqta kay marcadores celulares inmunes kaqwan chanta kay expresión NNMT kaqwan.
PBMC nisqakunataqa t’aqarqankun leucocitos t’aqay rurukunamanta (STEMCELL Technologies) centrifugación de densidad de gradiente de Ficoll nisqawan. CD3 + células nisqakunatam PBMC nisqamanta hurqurqaku CD3 perlaswan (Miltenyi). MNA kaptin utaq mana kaptin, células CD3+ activadas karqanku kay CD3 placaman watasqa (5μg/ml), CD28 soluble (3μg/ml) chanta IL-2 (300 U/ml; Proleucina) kaqwan. Mastarikuypa qipa punchawninpim, citometría de flujo nisqawan chaninchakurqa viabilidad (Fixable Viability Dye eFluor450, eBioscience) chaynallataq proliferación (123count eBeads, Thermo Fisher Scientific) nisqapas. Chaninchana efector ruwayta kay células kaqta PMA kaqwan (20 ng/ml) chanta ionomicina (1μg/ml) kaqwan GolgiStop kaqwan 4 horasta kallpachaspa, chanta kay CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4) , BioLegend) chanta TNFα-fluoresceína isotiocianato (FITC) (MAb11, BD) kaqwan qhaway. Células qPCR y ChIP nisqakunata PMA (20 ng/ml) hinaspa ionomicina (1μg/ml) nisqawan 4 horasta kallpanchana. Chay ELISA sobrenadante nisqa huñusqa karqa manaraq estimulación ruwasqa kachkaptin hinaspa PMA (20 ng/ml) hinaspa ionomicina (1 μg/ml) nisqawan 4 horas.
Ruwaqpa protocolonta qatiy ARNta t’aqanapaq RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN) nisqawan. QIAshredder (QIAGEN) nisqawanmi muestrata homogeneizana. Hatun atiyniyuq ARNmanta ADNcman kit (Thermo Fisher Scientific) nisqawan ADN complementario (ADNc) nisqa sintetizanapaq. TaqMan Rapid Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) nisqawan, kay sondakunawan, expresión génica (ruraqpa protocolonman hina) yupanapaq: Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs00427552_m1 (SLC22A1), Hs02786624_g1 [gliseraldehído-3-fosfato off Hidrógeno (GAPDH)] chaymanta Hs01010726_m1 (SLC22A2). Chay muestrakunam puririchisqa karqa StepOnePlus chiqap pacha PCR sistemapi (Applied Biosystems) (Applied Biosystems) MicroAmp rápido óptico 96 pozoyuq reacción placapi (Applied Biosystems) MicroAmp óptica películawan. Ima Ct chanipas 35manta aswan kaqqa umbral de detección nisqamanta aswan hatun kananpaqmi qawarisqa, chaymi mana tariy atina hina marcasqa.
ChIP nisqa ruway ñawpaq willasqa hina (58). Pisi rimayllapi, células nisqakunataqa formaldehído nisqawanmi hampirqaku (concentración final 1,42%) hinaspam 10 minuto temperatura ambiente nisqapi incubarqunku. Utilizar suplementado tampón hinchazón (25 mM Hepes, 1,5 mM MgCl2, 10 mM KCl y 0,1% NP-40) kay hielopi 10 minutos, chaymanta resuspendiy kay tampón inmunoprecipitación kaqpi imaynachus willasqa ( 58 ). Chaymantaqa muestraqa kay ciclokunawanmi sonicado karqa: 10 ciclos (20 pulsos de 1 segundos) hinaspa tiempo estático 40 segundos. ChIP-grado inmunoglobulina G (Tecnología de Señalización Celular; 1μl), histona H3 (Tecnología de Señalización Celular; 3μl), NFAT (Invitrogen; 3μl) chaymanta SP1 (Tecnología de Señalización Celular; 3μl) nisqa anticuerpos nisqakunata muestrawan 4°CC kuyuchiypi huk tuta incubar. Proteína A nisqa perlaskunata (Thermo Fisher Scientific) muestrawan 4°C nisqapi llamp’ullata kuyuchispa 1 horata incubarquna, chaymantataq chelex nisqa perlaswan (Bio-Rad) ADN nisqa qhapaqyachinapaq, chaymantataq proteinasa K (Thermo Fisher) nisqawan proteína nisqa digestión nisqapaq. TNFα promotorqa PCR nisqawanmi tarikurqa: ñawpaqman, GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT; aswanpas, GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (207-bp ruru). Chay siq’ikunaqa Image Lab (Bio-Rad) nisqawanmi ruwasqa karqan, chaymantataqmi ImageJ software nisqawan yupasqa karqan.
Chay sobrenadante de cultivo celular nisqataqa huñurqakum ñawpaqpi willakusqanman hina. Kay determinación ruwakurqa ruwaqpa ruwayninkunamanhina kay runa TNFα ELISA kit (Invitrogen), runa IL-2 ELISA kit (Invitrogen) chaymanta runa IFN-γ ELISA kit (Abcam). Ruwaqpa protocolonman hinaqa, chay sobrenadante nisqatam 1:100 diluirqurqaku TNFα hinaspa IL-2 nisqa tarinapaq, 1:3ñataqmi IFN-γ nisqa tarinapaq. EnVision 2104 Multilabel Reader (PerkinElmer) nisqawanmi 450 nm nisqapi absorbancia nisqa tupuna.
PBMC nisqakunataqa t’aqarqankun leucocitos t’aqay rurukunamanta (STEMCELL Technologies) centrifugación de densidad de gradiente de Ficoll nisqawan. CD3 + células nisqakunatam PBMC nisqamanta hurqurqaku CD3 perlaswan (Miltenyi). MNA kaptin utaq mana kaptin, células CD3+ activadas karqanku kay CD3 placaman watasqa kaqwan (5μg/ml), CD28 soluble kaqwan (3μg/ml) chanta IL-2 kaqwan (300 U/ml; Proleucina) 3 p’unchawkama. 3 punchawmanta, células nisqakunata huñuspa mayllarqaku 0,9% salinawan, chaymantam pellet nisqataqa snap congelarqaku. Célula yupayqa ruwakurqa citometría de flujo nisqawan (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R configuración) 123count eBeads nisqawan.
Metabolitos nisqakunata hurquy hawapi nisqanchikman hina. Chay ch’akisqa extractoqa 4000 equivalentes celulares/μl nisqapi musuqmanta ruwasqa karqa. Chay muestrataqa analizana cromatografía de fase inversa nisqawan (1290 Infinity II, Agilent Technologies, Santa Clara, CA) chaymanta columna CORTECS T3 nisqawan (2,1×150 mm, tamaño de partículas 1,6-μm, tamaño de poros 120-Å; #186008500, Waters). Espectrómetro de masas polares (6470, Agilent), chaypiqa ionización electrospray nisqawanmi llamkan modo positivo nisqapi. Fase móvil A nisqaqa 0,1% ácido fórmico (H2O nisqapi), fase móvil B 90% acetonitrilo, 0,1% ácido fórmico. Gradiente LC nisqa 0manta 2 minutokama 100% Apaq, 2manta 7,1 minutokama 99% Bpaq, 7,1manta 8 minutokama 99% B. Chaymantaqa columnata yapamanta equilibrana fase móvil Awan caudal 0,6 ml/min 3 minutokama. . Chay caudal nisqa 0,4ml/min nisqa, chaymantam cámara de columna nisqa 50°C nisqaman ruphaykachisqa. MNApa chuya químico nisqa kamachikuyninta (M320995, Toronto Research Chemical Company, North York, Ontario, Canadá) llamk’achiy, chaywanmi churana pacha waqaychay (RT) hinallataq tikray (RT = 0,882 minutos, tikray 1 = 137→94.1, tikray 2 = 137→92 , Tikray 3 = 137→78). Kimsantin transiciones allin retención tiempopi ruwakuptinqa, transición 1 nisqa cuantificación nisqapaqmi especificidad nisqa kananpaq. Chay curva estándar de MNA (Toronto Research Chemical Company) nisqa suqta diluciones seriales nisqawanmi ruwakurqa chay solución de stock (1 mg/ml) nisqawan, chaynapi 0,1, 1,0, 10 hinaspa 100 ng/ml nisqa normakuna chaynallataq 1,0 hinaspa 10μg/ml nisqa líquido nisqa. Kay limite de detección kaqqa 1 ng/ml, chanta kay lineal kutichiyqa 10 ng/ml chanta 10μg/ml kaqkama. Sapa inyección iskay microlitro muestramanta chaymanta estándarmanta ruwasqa anlisis LC/MS kaqpaq, chaymanta huk muestra control de calidad mixta sapa pusaq inyeccionkunapi puririchisqa, chaynapi plataforma de análisis nisqapa estabilidad nisqa kananpaq. Llapan MNAwan hampisqa células muestrakunapa MNA kutichiyninkunaqa ensayo nisqapa lineal nisqapa ukunpim karqa. Willakuykunata t’aqwiyqa ruwakurqa MassHunter nisqa software análisis cuantitativo nisqawanmi (v9.0, Agilent).
Iskay kaq miray αFR-CAR ruwayqa Song et al. (59) nisqa. Pisi rimayllapi, kay ruwayqa kay contenidos kaqta hap’in: CD8a umalliq secuencia, runa αFR-específico huk cadena variable fragmento, CD8a bisagra chanta transmembrana región, CD27 dominio intracelular chanta CD3z intracelular dominio. Kay hunt’asqa CAR secuenciaqa GenScript kaqwan sintetizasqa karqa, chaymanta clonasqa karqa kay iskay kaq miray lentiviral expresión vector kaqman upstream kaqpi kay GFP expresión cassette kaqmanta llamk’achisqa chaninchaypaq kay transducción eficiencia kaqmanta.
Lentivirusqa ruwakun kay transfección kaqwan kay células HEK293T kaqmanta [American Type Culture Collection (ATCC); wiñasqa kay Dulbeccopa modificado medio Eagle kaqpi mayqinchus 10% suero fetal bovino (FBS) chanta 1% PenStrep kaqwan, chanta kay vector CAR-GFP kaqwan llamk’achisqa chanta Kay plásmidos de empaquetado (psPAX2 chanta pMD2.G, Addgene) llamk’achinku kay amina lipofección (Sigma-Aldrich) kaqwan. Chay virus nisqayuq sobrenadante nisqa huñusqa karqa 48 hinaspa 72 horas transfección nisqamanta, filtrado hinaspa concentrado ultracentrifugación nisqawan. Chay concentrado viral sobrenadante nisqataqa -80°C nisqapi waqaychay transducción nisqakama.
PBMC nisqakunaqa t’aqasqa kanku qhali donante leucocitos t’aqay rurukunamanta (STEMCELL Technologies) Ficoll centrifugación de densidad de gradiente nisqawan. Kay microperlas CD8 akllana positiva kaqwan (Miltenyi) kay CD8+ células kaqta PBMC kaqmanta t’aqanapaq. Células T nisqakunata kallpachay TransAct (Miltenyi) nisqawan hinallataq TexMACS medio nisqapi [Miltenyi; yapasqa 3% runap suero inactivado ruphaywan, 1% PenStrep kaqwan chanta IL-2 kaqwan (300 U/ml)]. Iskay chunka tawayuq horas estimulación kaqmanta, células T transducidas karqanku lentivirus kaqwan (10 μl concentrado virus sobrenadante sapa 106 células kaqpi). 1manta 3 p’unchawkama transducción kaqmanta Cytek Aurora kaqpi (FSC (Forward Scatter)/SSC (Side Scatter), Singlet, GFP+ kaqpi), chaninchay kay GFP expresión kaqmanta kay células kaqmanta rikuchinapaq huk eficiencia transducción kaqmanta aswan pisi 30% kaqmanta .
Células CAR-T nisqakunatam 24 horas Immunocult nisqapi (STEMCELL Technologies; 1% PenStrep nisqawan yapasqa) kay condicionkunapi uywarqaku: mana hampisqa, 250 μM adenosinawan utaq 10 mM MNAwan hampisqa. Ñawpaq hampiymantaqa, células CAR-T nisqakunatam PBS nisqawan mayllarqaku hinaspam 20.000 células SK-OV-3 nisqawan hukllawarqaku [ATCC; kay McCoy 5A medio kaqpi (Sigma-Aldrich) 10% FBS kaqwan chanta 1% PenStrep kaqwan yapasqa 10 kaqpi: Kay efectormanta meta kaqman ratio 1 kaqmanta kimsa kutipi amplificasqa karqa kay medio Inmunocult suplementado kaqpi. SK-OV-3 células chaymanta SK-OV-3 células lisas digitalis saponinawan (0,5mg/ml; Sigma-Aldrich) control negativo hinallataq positivo hina llamk’achikurqa, chaymanta. 24 horas kuska tarpuymanta, chay hawa yakuta huñuspa, lactato deshidrogenasa (LDH) nisqa tupusqa, ruwaqpa kamachisqanman hina (LDH Glo Cytotoxicity Assay Kit, Promega). Chay LDH hawa yakuqa 1:50 tampón LDH nisqapi diluido karqa. Sapa pachakmanta wañuchiyqa tupukurqa kay fórmula nisqawan: pachakmanta huknin wañuchisqa = pachakmanta huknin allichay / tasa máxima wañuchiy x 100%, maypichus pachakmanta huknin allichay = células co-cultivo-T nisqalla, chaymanta tasa máxima wañuchiy = control positivo-negativo.
Qillqapi utaq materialkunapi chaymanta ruwaykunapi willasqa hina, GraphPad Prism 8, Microsoft Excel utaq R v3.6.0 kaqwan llamk'achiy análisis estadístico kaqpaq. Sichus achka muestrakuna huñusqa kanku huk unqusqamanta (kayhina ascitis chaymanta tumor), huk prueba t pareada kaqwan llamk’achiyku utaq unqusqata huk efecto aleatorio hina huk modelo lineal utaq generalizado kaqpi allin kasqanmanhina churayku. Análisis metabolómico nisqapaqqa, prueba de importancia nisqa kimsa kutipi ruwakun.
Kay qillqasqapaq yapasqa materialkunapaq, ama hina kaspa qhaway http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1
Kayqa huk kichasqa yaykuy qillqam, Creative Commons Atribución-Mana Comercial Licenciapa kamachiyninkunamanhina rakisqa, mayqinchus mayqin mediopipas llamk'achiyta, rakiyta chaymanta mirachiyta saqin, qhipa llamk'achiyta mana qhatuypaq gananciapaqchu chaymanta premisa ñawpaq llamk'ay chiqan kasqan. Willakuy.
Qhaway: Correo electrónico direccionniyki qunaykipaqlla mañaykiku chaymanta chay p'anqaman yuyaychasqayki runa yachanqa chay correo electrónico rikunankuta munasqaykita chaymanta mana spam kaqta. Manam ima correo electrónico direccionkunatapas hapisaqkuchu.
Kay tapuyqa watukuq kasqaykita pruebanapaq chaymanta kikillanmanta spam apachiyta hark'anapaq llamk'achkan.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacarias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), Ralph J. De Bellardini (Ralph J. DeBerardinis), Russell G. Jones (Russell G. Jones), Phineas T. Hamilton sutiyuq runa (Phineas T.
MNA yanapakun kay inmune supresión kaqpi kay células T kaqmanta chanta huk potencial inmunoterapia diana kaqta representan kay runap cáncer hampiyninpaq.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacarias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), Ralph J. De Bellardini (Ralph J. DeBerardinis), Russell G. Jones (Russell G. Jones), Phineas T. Hamilton sutiyuq runa (Phineas T.
MNA yanapakun kay inmune supresión kaqpi kay células T kaqmanta chanta huk potencial inmunoterapia diana kaqta representan kay runap cáncer hampiyninpaq.
©2021 Asociación Americana para el Avance de la Ciencia nisqa. tukuy hayñikuna waqaychasqa. AAAS nisqaqa HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef hinaspa COUNTER nisqakunapa yanapaqninmi. CienciaAvances ISSN 2375-2548 nisqapi.